Funkcije Trombocita

Laboratorijske metode za procjenu učinkovitosti anti-trombocitne terapije

Kardiovaskularnie bolesti, ubica broj jedan u SAD-u i širom svijeta, odgovorne su za oko 30% svih smrtnih slučajeva. Istraživanja su pokazala da se aterosklerotski plakovi razvijaju tijekom vremena. Kada plak rupturira on izlaže arterijski ekstracelularni matriks te inicira agregaciju trombocita ili aterotrombozu.

U isto vrijeme, tkivni čimbenik produciran od strane pjenastih stanica prijekla iz makrofaga također potiče kaskadu zgrušavanja krvi. Ovi događaji su odgovorni za širenje ugruška i mogu uzrokovati kliničke bolesti, u rasponu od moždanog udara do infarkta miokarda (IM).

Danas, inhibitori trombocita su sastavni dio prevencije i terapije za akutne vaskularne događaje. Postoje tri glavne skupine inhibitora trombocita: aspirin; derivati theinopyridina, uključujući clopidogrel (Plavix); i antagonisti GP IIb/IIIa receptora. Budući da su antagonisti GP IIb/IIIa dostupni samo u intravenskom obliku, oni se ne koriste za dugoročno liječenje bolesnika izvan bolnice. S druge strane, aspirin i clopidogrel se obično uzimaju od strane pacijenata kako bi se smanjio dugoročni rizik za bolesti srca.

U novije vrijeme, intenzivirana je rasprava o tome da li klinički laboratoriji trebaju mjeriti efekte aspirina i clopidogrela na funkciju trombocita. U ovom članku, raspravljat će se o farmakologiji antitrombocitnih lijekova i laboratorijskim testovima koji su na raspolaganju za mjerenje njihovog učinka.

Trombociti i formiranje ugruška

Trombociti igraju integralnu ulogu u normalnoj hemostazi. Nedostaje im jezgra, a sadrže alfa granule sastavljene iz fibrinogena, trombocitnog faktora rasta, von Willebrandovog faktora (vWF), P-selektina, trombocitnog faktora 4, i gustih granula koje sadrže adenozin difosfat (ADP), serotonin i kalcij.

Kada dođe do oštećenja krvnih žila, izloženi vWF i kolagen vežu se za cirkulirajuće trombocite te ih aktiviraju. Tijekom ove aktivacije, sadržaj alfa i gustih granula se otpušta (degranulacija) i aktivira još više trombocita na mjestu oštećenja krvne žile. Također, trombociti sintetiziraju i otpuštaju tromboksan, još jedan posrednik aktivacije.

Tijekom aktivacije trombocita, GP IIb/IIIa receptor na površini stanice prolazi kroz oblik koji omogućuje promjenu fibrinogena (Factor I) I njegovo vezivanje za trombocite. U isto vrijeme, trombin pretvara fibrinogen u fibrin kao dio kaskade koagulacije krvi. Faktor XIII unakrsno povezuje fibrin u jednom od posljednjih koraka kaskade. Taj složeni slijed interakcija uzrokuje formiranje stabilnog trombocitnog čepa i predstavlja osnovu hemostaze (slika 1).

 

Slika 1. Putevi aktivacije trombocita. Ova pojednostavljena slika prikazuje temeljne korake u formiranju ugrušaka. In vivo process formiranja ugruška je rezultat dvaju različitih puteva, kaskade koagulacije krvi (lijevo) i aktivacije trombocita (desno).

 

Aspirin: Mehanizam djelovanja

Aspirin (acetilsalicilna kiselina) ima dugu povijest kao analgetik za ublažavanje manjih bolova. Ovaj jeftin i široko dostupan lijek također smanjuje rizik od prvog IM u muškaraca i moždanog udara u žena. U bolesnika s visokim rizikom za vaskularne bolesti, on je povezana sa do 25% smanjenja smrtnih ishoda vezanih za vaskularne uzroke, IM i moždanog udara. Aspirin je također indiciran kao dio terapije za sekundarnu prevenciju kardiovaskularnih događaja u bolesnika s povijesti bolesti koronarnih arterija, cerebrovaskularne bolesti ili periferne vaskularne bolesti.

Aspirin djeluje tako što ireverzibilno acetilira serin 530 ciklooksigenaze 1 (COX-1). Ovaj enzim ima ključnu ulogu u putu koji pretvara arahidonsku kiselinu u medijatore koji mogu povećati agregaciju trombocita (agonist) ili smanjiti je (antagonist). Istraživanja pokazuju da aspirin smanjuje rizik od kardiovaskularnih bolesti smanjenjem proizvodnje tromboksana, moćnog trombocitnog agonista, u većoj mjeri nego antagonista, kao što su prostaciklin i drugi metaboliti arahidonske kiseline. Stoga, ukupni efekat aspirina je smanjenje agregacije trombocita.

Definicije otpornosti na Aspirin

Postoji nekoliko različitih shema za određivanje učinaka aspirina na funkcije trombocita i isto tako za definiranje pojedinca otpornih na terapiju aspirinom. Istraživači su predložili različite laboratorijske definicije otpornosti na aspirin, na temelju funkcionalnih trombocitnih testova, mjerenjem serumskih ili urinskih metabolite tromboksana i farmakološki mehanizam otpora.

U osoba sa Tipom I, ili farmakokinetičkim otporom, aspirin ne inhibira COX-1, unatoč adekvatno uzetim dozama. Istraživanja pokazuju da je razina salicilata u tih pojedinaca ne dovoljno visoka da inhibira COX-1, zbog malapsorpcije ili genskih polimorfizama u COX-1. Kod Tipa II, ili farmakodinamičkog otpora, nastavlja se proizvodnja tromboksana unatoč adekvatne COX-1 inhibicije. Drugi enzimi, kao što je COX-2, također mogu proizvesti tromboksan, što može objasniti ovu vrstu otpornosti na aspirin. U pseudoresistanciji, ili Tipa III, aspirin efektivn gasi produkciju tromboksana. Aktivnost trombocita još uvijek se može dogoditi preko tromboksan-nezavisnih puteva, kao što su aktivacija trombinom, ADP-om ili adrenalinom. Dok su ove definicije korisne za razumijevanje različitih bioloških mehanizama koji dovode do aktivacije trombocita i aterotromboze čak i kada pacijenti uzimaju aspirin, važno je shvatiti da nema standardne definicije otpora na aspirin.

Testovi za mjerenje utjecaja aspirina na funkciju trombocita

Laboratoriji imaju nekoliko opcija za mjerenje funkcije trombocita u bolesnika koji primaju terapiju aspirinom.

Optička agregometrija transmisijom svjetlosti (Optical Light Transmission Aggregometry). Trenutni zlatni standard je metoda optičke agregometrije transmisijom svjetlosti (LTA). Ovaj test zahtijeva citrirani uzorak krvi koji je centrifugiran radi stvaranja trombocima bogate plazme, sa 200-300 x 109 trombocita/L). Za izvođenje testa, tehnolog stavlja uzorak plazme bogate trombocitima u kivetu agregometra zajedno sa agonistima trombocita, kao što je ADP, arahidonska kiselina, ili adrenalin, što izazva agregaciju trombocita. Kako trombociti agregiraju, mutnoća plazme bogate trombocitima u kiveti se smanjuje, i mjeri se povećanje transmitance (prolaska) svjetlosti kroz vrijeme. Agregometri koji obavljaju LTA su dostupni od nekoliko proizvođača.

Istraživanje je pokazalo da dob, spol, rasa i hematokrit utiču na agregaciju trombocita mjerenu sa LTA. Osim toga, pre-analitičke varijable vezane za aktivaciju trombocita tijekom prikupljanja uzoraka i obrade stvaraju varijabilnost u rezultatima. Iako ne postoji opće prihvaćena definicija otpora na aspirin mjerena sa LTA, mnoge studije su kao metriku koristile ≥ 20% agregacije kao odgovor na arahidonsku kiselinu i/ili ≥ 70% agregacije kao odgovor na ADP.

Mnogi laboratoriji vole LTA jer je to jedan od rijetkih testova koji je predvidio ishode u bolesnika na terapiji aspirinom. Na primjer, osobe s više LTA definiranom aktivnosću trombocita imale su više kardiovaskularnih događaja u studiji. Međutim, test ima nekoliko nedostataka, uključujući činjenicu da zahtjeva puno vremena i rada, teško ga je standardizirati, a može biti i varijabilan ovisno o operatoru.

IN vitro vrijeme krvarenja. Druga tehnologija za procjenu funkcije trombocita je dostupna na specijaliziranom instrumentu. Analizator funkcije trombocita-100 (PFA-100, Siemens Healthcare Diagnostics, Slika 2.) koristi tehnologiju koja radi na principu prolaska krvi kroz kapilarnu cijev s vrlo malim otvorom koja je obložena agonistom koji uzrokuje agregaciju trombocita. Aktivacijom trombocita, oni prijanjaju na otvor i zaustave krv da protiče kroz kapilarnu cijev. Instrument mjeri vrijeme koje je potrebno da se otvor zapuši i bilježi to kao vrijeme krvarenja in vitro. Zbog sličnosti sa konvecionalnim testom vremena krvarenja , PFA – 100 rezultati se ponekad nazivaju „in vitro vrijeme krvarenja”.

Studije korištenjem PFA-100 ukazuju da većina bolesnika na terapiji aspirinom imaju produženo in vitro vrijeme zgrušavanja. Međutim, procenat bolesnika koji imaju relativno normalno vrijeme zgrušavanja, uprkos uzimanju aspirina, je varirao, što je jedan od potencijalnih nedostataka ove tehnologije. PFA-100 test za rezistenciju aspirina ima neke posebne prednosti. Najznačajnije: brz test, koristi punu krv, što znači da pacijenti mogu biti testirani u različitim nivoima zdravstvene zaštite. Nadalje, laboratoriji mogu standardizirati PFA -100 rezultate bolje od onih dobivenih sa LTA, kao i korištenje testa za procjenu nasljednih poremećaja trombocita. S negativne strane, istraživanja su koristila razne cut-off za utvrđivanje otpornosti aspirina, a tehnologija nije specifičan za rezistenciju aspirina. Na primjer, pacijenti s von Willebrandovom bolesti i drugim abnormalnostima trombocita će imati produženo in vitro vrijeme zgrušavanja iako nisu uzimali aspirin. Hematokrit i broj trombocita također utječu na rezultate testa.

siemenspfa100

PFA -100 testira funkciju trombocita i koristi high shear – protok oponaša in vivo hemostazu. Instrument koristi punu krv i daje rezultate u 4-8 minuta.

 

Spremnik na bazi agregacije trombocita. VerifyNow Aspirin test (Accumetrics, Slika 3) je još jedna tehnologija za procjenu učinka aspirina na funkciju trombocita. Testne patrone sadrže aktivator specifičan za tromboksan – inducirane aktivacije trombocita, čineći test specifičnijim za aspirin – inducirane inhibicije trombocita nego test vremena krvarenja in vitro. Unutar testne patrone, fibrinogen obloži mikročestice agregata kao reakcija na trombocita aktivaciju, što je rezultiralo povećanjem propusnost za svjetlo slično LTA. Accumetrics predlaže prekid vrijednost iznad koje pacijenti su klasificirani da imaju pod-optimalan odgovor na aspirinsku terapiju. Ova vrijednost je iskazana u proizvoljno agregiranju jedinica definirane od strane tvrtke.

Jedna od glavnih prednosti VerifyNow tehnologije je je brze vrijeme obrta koristeći cijeli uzorak krvi. U principu, test također identificira manje populacije rezistentnih pacijenata u uporedbi s PFA-100. S druge strane, rezultati generalno pokazuju slabu podudarnost s drugim testovima koji se smatraju zlatnim standardima za procjenu efekta aspirina, kao što su LTA i mjerenje u serumu ili urinu tromboksan metabolita.

verifynow

VerifyNow instrument je automatski analizator koji koristi jednokratne patrone za mjerenje funkcije trombocita. Instrument može testirati odgovor i aspirina i clopidogrela i daje rezultate za 5 minuta ili manje.

 

Clopidogrel: Mehanizam djelovanja 

 Kliničari propisuju clopidogrel radi smanjenja rizika MI, nestabilne angine, moždanog udara i kardiovaskularne smrti kod pacijenata s kardiovaskularnim bolestima. Ovaj oralni, thienopyridin, antitrombocitni lijek, smanjuje aktivnost trombocita, te je manje vjerovatno da oblikuju krvni ugrušak.

Lijek djeluje tako što se kovalentno i ireverzibilno vezuje na receptor P2Y12, glavni receptor uključen u ADP – induciranoj agregaciji trombocita. Formiranje aktivnog metabolita lijeka događa se u jetri; dakle, genetski polimorfizam u jetrenim enzimima CYP2C19 odgovoran je za metabolizam lijeka, čini se da igra važnu ulogu na anti-trombocitne efekte clopidogrela. Slično testiranju aspirinske rezistencije, istraživači su koristili različite definicije rezistencije na clopidogrel. Najčešća laboratorijska definicija uključuje ADP – induciranu agregaciju trombocita po LTA, mjerenu prije i poslije uzimanja lijeka. Mnogi istraživači su koristili smanjenje u agregaciji trombocita ≥30% kao dokaz učinkovitosti lijeka. Rezistencija varira od <10% smanjenje u ADP – induciranoj agregaciji po LTA do <20% smanjenja u agregaciji.

Testovi za mjerenje učinkovitosti Clopidogrela na funkciju trombocita

Optical Light Transmission Aggregometry. LTA je generalno navodi kao zlatni standard za definisanje odgovora na clopidogrel. Prednosti ove tehnologije uključuju njeno prihvaćanje kao zlatni standard i specifičnosti za stvarni farmakološkim mehanizam lijeka, ADP-inducirana aktivacija trombocita. Nedostaci su većinom isti kao kad se koristi za praćenje aspirinske terapije: nedostatak standardizacije, radni uvjeti i potreba za plazmom koja je bogata trombocitima.

Cartridge-based Platelet Aggregation. VerifyNow P2Y12 test (Accumetrics) takođe mjeri učinkovitost zgrušavanja trombocita pored clopidogrela. Isti test se može koristiti za druge P2Y12 inhibitore. Princip uređaja je isti kao test za aspirin, ali patrona koristi ADP da inducira agregaciju trombocita i normalizira rezultate poredeći ih sa aktivacijom u prisustvu trombina , snažan agonist trombocita. Test izvještava o procentu inhibicije trombocitne aktivacije sa clopidogrelom poredeći ADP induciranu sa trombin induciranom agregacijom.

Ovaj test daje brze rezultate iz uzorka pune krvi i relativno je specifična za clopidogrel – induciranu inhibiciju trombocita. Rezultati testa, međutim pokazuju slabu podudarnost sa LTA. Istraživači su izvjestili o velikoj varijabilnosti u odgovoru pacijenata s nekim studijama od 45 – 50% rezistencije. Broj trombocita i upotreba inhibitora trombocita mogu uticati na rezultate testa.

Tromboelastografija. Thromboelastography (TEG) je drugi način za procjenu uticaja clopidogrela na funkciju trombocita (Slika 4). Da bi se izveo test, tehničar dodaje punu krv u plastične čaše obložene agonistom koji inicira zgrušavanje. Instrument ima iglu koja je zakačena za torzijsku žicu. Kada se igla spusti u čašu, čaša se počne rotirati, uzrokujući stvaranje ugruška. Ugrušak stvara napetost na žici što instrument registruje i proizvodi krivu. To je krivulja maksimalne amplitude (MA), koja odražava funkciju trombocita. Za procjenu odgovora clopidogrela test se vodi sa ADP-, fibrin- i kaolin obloženim čašama.

Neke laboratorije preferiraju TEG je radi sa uzorkom pune krvi i takođe može se upotrebljavati za procjenu inhibitorne uloge aspirina na trombocitnu funkciju koristeći arahidonsku kiselinu, fibrin i kaolin kao agoniste.

Relativno je specifična za efekte clopidogrela na trombocite i daje informacije o funkciji trombocita kao faktore zgrušavanja i koncentracije fibrinogena. S druge strane TEG zahtjeva intenzivan rad i nema standardizacije. Nadalje, test ovisi o izračunima koji uključuju više i relativno nepreciznih parametara.

thromboelastography

TEG mjeri funkciju trombocita formirajući vještačke uvjete zgrušavanja u uzorku pune krvi. Ugrušak se formira između torzijske žice i igle uronjene u specijaliziranu čašu za uzorak i instrument bilježi vrijeme stvaranja ugruška i maksimalnu snagu ugruška. Rezistencija na aspirin i clopidogrel može se mjeriti sa ovim instrumentom.

Ostale metode

Dok laboratorije trenutno imaju više metoda za procjenu funkcije trombocita kod pacijenata na terapiji aspirinom ili clopidogrelom, duge nove tehnologije su dostupne za upotrebu. Što uključuje: The Platelet Works (Helena Laboratories), Cone and Plate(let) Analyzer (Matis Medical), i protočna citometrijska procjena različitih receptora na površini trombocita. Fosforilizacija vazodilatator – stimulirajućeg proteina (VASP, Diagnostica Stago) zaslužuje poseban spomen. Istraživači su koristili ovu tehnologiju u preeliminarnim studijama kao alternativni zlatni standard za procjenu efekta clopidogrela na funkciju trombocita.

Završna ocjena

Terapija aspirinom i clopidogrelom su postale standard za prevenciju povratnih aterotromboza. Ova dva lijeka utiču na funkciju trombocita različitim mehanizmima. Aspirin reducira tromboksan – posredovanu agregaciju trombocita, dok clopidogrel parcijalno prevenira ADP – induciranu aktivaciju trombocita.

Budući da pacijenti pokazuju značajne varijabilnosti u odgovoru na ove lijekove, laboratorijska mjerenja funkcije trombocita može jednog dana igrati ulogu u uspješnom liječenju.

Međutim, nije jasno koji test ili uređaj nudi najvrjedniju procjenu inhibicije aktiviranja trombocita. Zato, zaposleni u laboratorijama će morati pratiti nove razvoje u ovom području.

Preporučena literatura

Eikelboom JW, Hankey GJ, Thom J, Bhatt DL, et al. Incomplete inhibition of thromboxane biosynthesis by acetylsalicylic acid. Determinants and effect on cardiovascular risk. Circulation 2008;118:1705–12.

Gum PA, Kottke-Marchant K, Welsh PA, White J, et al. A prospective, blinded determination of the natural history of aspirin resistance among stable patients with cardiovascular disease. J Am Coll Cardiol 2003;41:961–5.

Harle CC. Point-of-care platelet function testing. Semin Cardiothorac Vasc Anesth 2007;11:247–251.

Interindividual variability in the response to oral antiplatelet drugs: a position paper of the Working Group on antiplatelet drugs resistance appointed by the Section of Cardiovascular Interventions of the Polish Cardiac Society, endorsed by the Working Group on Thrombosis of the European Society of Cardiology. Eur Heart J 2009;30:426–35.

Lordkipanidze M, Pharand C, Nguyen TA, Schampaert E, et al. Comparison of four tests to assess inhibition of platelet function by clopidogrel in stable coronary artery disease patients. Eur Heart J 2008;29:2877–85.

Madsen EH, Saw J, Kristensen SR, Schmidt EB, et al. Long-term aspirin and clopidogrel response evaluated by light transmission aggregometry, VerifyNow, and thromboelastography in patients undergoing percutaneous coronary intervention. Clin Chem 2010;56:839–47.

Michelson AD, Cattaneo M, Eikelboom JW, Gurbel P, et al. Aspirin resistance: position paper of the working group on aspirin resistance. J Thromb Haemost 2005;3:1309–11.

Michelson AD. Methods for the measurement of platelet function. Cardiol 2009;103[suppl]:20A–26A.

Serebruany VL, Goto S. The challenge of monitoring platelet response after clopidogrel. Eur Heart J 2008;29:2833–4.

 

Izvor: Clinical Laboratory News

Be the first to comment

Leave a Reply