Vitamin D Testiranje

Kako uraditi ispravno?

Tokom zadnjih 10 godina, istraživači su napravili brojna uzbudljiva otkrića o vitaminu D. Smatra se da prohormon igra značajnu ulogu u stanju domaćina, uključujući određene karcinome, tip 1 dijabetes, multiplu skelerozu, tuberkulozu, Alzheimerova bolest, psorijaza i svi uzroci smrtnosti.

Uz sve medijsku pažnju na supermoći vitamina D , potražnja za testiranje vitamina D je porasla i liječnici i pacijenti sada daju ozbiljnu pažnju na status vitamina D. Većina ljudi su svjesni da vitamin D može se dobiti izlaganjem kože suncu, konzumiranjem određenih namirnica, ili uzimanje vitaminskih dodataka. Vitamin D je sam po sebi biološki inertan i mora proći dvije hidroksilacijske reakcije da bi se aktivirao. Prvi korak je kataliziran sa jetrenim enzimom, dajući 25-hidroksivitamin D (25(OH)D), metabolit koji je prikladan pokazatelj statusa vitamina D (1). Zadnje tri dekade, kliničari su se oslonili primarno na imunotestove za ovaj metabolit da se odredi status vitamina D pacijenta.

Danas, nova tehnologija se pojavila za mjerenje statusa vitamina D, uključujući i likvidnu kromatografiju visokog učinka (HPLC) zajedno sa masenom spektrometrijom LC-MS/MS). Naš laboratorij u CDC je mjerio 25(OH)D za istraživanje iz NHANES (National Health and Nutrition Examination Surveys) III (1988–1994) krot NHANES 2005–2006. Ovdje ćemo predstaviti naše iskustvo sa analitičkim kvalitetom komercijalno dostupnih imunotestova za vitamin D i nove analitičke metode razvijene u CDC kao i opis našeg iskustva sa novijim dostupnim standardnim referentnim materijalom.

Istorija testova za vitamin D

Prvi metod za mjerenje 25(OH)D je bio konkurentan protein-vezujućem testu koji je koristio vezujući-protein vitamina D štakora i 3H-označeni 25(OH)D3 (2). Ovaj test je kasnije bio zamjenjen sa jednostavnijim radioimunotestom (RIA) koristeći 3H i kasnije 125I-označeni 25(OH)D (3).

Sve dok konkurentni vezujući testovi se koriste u kliničkim laboratorijima, naučnici su koristili metode na bazi hemije kao što su HPLC s UV detekcijom ili gasnu ili likvidnu hromatografiju vezana uz masenu spektrometrije (MS) za mjerenje ili potvrdu serumske koncentracije od 25 (OH) D (4-6).

Hromatografske metode su manje osjetljive na efekte uzorka od imunotestova (7). Ustvari , LC-MS/MS prvo rješava komponente hromatografski a onda ih detektuje u određenim masama. Ova metodologija daje veliku vjerovatnoću da će molekula koja nas interesuje biti tačno identificirana i kvantificirana jer je detektovan kao specifični prelaz iz jednog masenog fragmenta u drugi. Drugim riječima, to je visoko specifični metod. Na dalje, u rastvoru izotopa LC-MS/MS, izotop vezani analog komponente od interesa se doda tokom prvog koraka pripreme uzorka i prisutan je tokom testa, korigujući za bilo koji potencijalni gubitak analita i ponašajući se gotovo identično kao komponenta od interesa tokom hromatografije i detekcije. U suprotnom, specifičnost je manje sigurna kada su analiti mjereni sa imunotestovima koji se oslajaju na vezanje za antitijela. Unakrsna reakcija sa nespecifičnim komponentama je dobro poznato pitanje u imunotestovima. Iako se opsežna testiranja na unakrsnu reaktivnost može provesti za vrednovanje imunoanaliza, to nikada nije iscrpno.

 

 

Bazirano na studiji iz najvećeg istraživanja ove vrste, Vitamin D External Quality Assessment Scheme (DEQAS, www.deqas.org), većina laboratorija koriste imunotestove da mjere 25(OH)D (Slika 1). Dok se broj učesnika DEQAS se skoro uduplao u posljednje 2 godine, broj korištenja LC-MS/MS je ostao isti 9 – 10%. Četiri najčešće korištena testa u ljeto 2009 su bila: DiaSorin Liaison Total (36%), IDS enzimski imunotest (19%), automatski IDS enzimski imunotest (11%), i LC-MS/MS (10%) (Slika 2).

 

 

NHANES studije sa komercijalnim 25(OH)D testom

Nutricijska laboratorija u CDC je mjerila 25(OH)D u više od 60.000 NHANES uzoraka koristeći DiaSorin RIA. CDC koristi analitičke metode bazirane na hromatografiji da bi izmjerila nutritivne indikatore; tako je upotreba RIA da se procjeni status vitamina D je bila izuzetak od pravila. Općenito, uprkos karakteristikama testova kao što su tačnost, preciznost, specifičnost, CDC hemičari i epidemiolozi nerado mijenjaju metode testova, jer svaka promjena otežava procjenu dugoročnih kretanja stanovništva za NHANES i zahtijeva opsežne cross-over studije da se povežu nove metode sa starim.

2004, CDC laboratorij je počeo da razvija LC-MS/MS metodu za mjerenja 25(OH)D. CDC su proveli ovu inicijativu, jer smo utvrdili da je 25 (OH) D imunotestu nedostajalo preciznosti potrebne za naše studije. Nadalje, u kasnim 1990-ih, proizvođač je napravio promjene na testu koji je uticao na rad i na rezultate našeg dugoročnog istraživanja. U reformuliranom testu, DiaSorin ugradio je antitijela sa većim afinitetom što je poboljšalo preciznost i senzitivnost kroz smanjenje nespecifičnog vezanja.

Kako je pokazano u kasnijim studijama, reformulirani DiaSorin test korišten tokom NHANES 2000–2006 mjerio je prosječno 12% niže nego orginalni test korišten za NHANES 1988–1994 (8, 9). Jedno objašnjenje za ovaj rezultat je da je veća specifičnost novog antitijela mjeren manjim brojem unakrsnih reaktanata. Nadalje, smo primijetili određene promjene u QC vrijednostima kao rezultat reagensa sa puno varijacija, što komplicira tumačenje podataka za NHANES (10).

Razumljivo, s vremena na vrijeme proizvođači će morati promijeniti serijske brojeve za različite dijelove setova, kao što su kalibratori, obilježivači ili antitijela. Ove promjene ne bi trebale uzrokovati sistemne pomake. Međutim, uočili smo nekoliko puta tokom analiza NHANES 2000-2006 uzoraka koji pretežno izvode test na jednoj ili drugoj strani srednje vrijednosti za određeni period.

Na temelju 11,3% intra-individualne koeficijent varijacije (CV) za 25 (OH) D (11), ciljevi za analitičku nepreciznost, trebali bi biti: 2,8% (optimalno), 5,6% (poželjno) i 8,5% (minimalna ) (12). Budući da proizvođač QC materijala odlikuje širokim QC granicama (18% -20%), generirali smo i karakterizirali velike serije QC materijala koji je trajao nekoliko godina i producirao uže QC granice (9% -14%). Ali ,i sa pomacima ,gore navedeno, ukupni CV za 25 (OH) D za 2000-2006 NHANES je bio 13% -15%. Ovaj iznos nepreciznosti ne ispunjava minimalne ciljeve za dobru preciznost, dakle, za našu dugoročnu studiju statusa vitamina D, odlučili smo nastaviti alternativnu analitičku metodu.

Razvoj LC-MS/MS testa

Razvoj testa za 25(OH)D nije bio jednostavan zadatak za CDC laboratoriju. Metoda Vogeser i sur. (13) bila je pogodna početna tačka jer smo imali pristup MicroMass Quattro LC TMS sistemu koji se koristio kao referentni metod. Ali od samog početka, nismo bili u mogućnosti da potvrdimo da je masa za punjenje (omjer m / z) 159 glavni proizvod jona za 25 (OH) D3. Umjesto toga, našli smo m/z 383 da bude glavni proizvod jon, što predstavlja gubitak vode kao što je prikazano od strane drugih (14, 15). U dodatku, htjeli smo mjeriti 25(OH)D2, koji nije rješen sa Vogeser et al. (13). Kao što smo istražili različite aspekte metode dok smo optimizirali instrument, primijetili smo da je matrica u kojoj su bili spremni kalibratori imao veliki utjecaj na odgovor detektora, općenito nalaz nije objavljen u drugim publikacijama kao analitičko pitanje (16).

Za potrebe uporedbe, pripremili smo kalibratore u 85% metanolu, 4% albumin u PBS ili serum. Preko raspona 10-100 ng /mL, intenziteti signala za oba analita u 85 % metanolu su oko 40% niže od onih u serumu i 15% niže od onih u 4% albumina. Najniža koncentracija kalibratora za 25(OH)D2 i 25(OH)D3 nisu detektibilne u 85% metanolu. Iako je interni standard kompenziran za razliku među različitim matricama, očekuje se da bi niži odgovori smanjili preciznost i tačnost testa, osobito pri niskim koncentracijama analita. Kalibracija otopina pripremljenih u serumu poput matrice će biti optimalna, ali korištenje seruma ili plazme koja sadrži endogeni 25(OH)D zahtijeva korekciju koji dodaje pogrešku na kalibracijske krivulje. Zato smo odlučili koristiti 4% albumine u PBS kako bi se osigurala-free protein matrica. Kroz naša nastojanja kalibracije, hidrofobna priroda 25(OH)D je bila briga. Brinula nas je adsorpcija analita na zidove epruveta te smo dizajnirali eksperimentu kojem smo posmatrali ponavljane trensfere otopina u čiste epruvete (16). Suprotno našim očekivanjima, pronašli smo pozitivnu interferenciju m/z 383 za 25(OH)D3 kada se koristi određeni brend poliuretanske epruvete. Interferencija približno duplira signal u QC bazenu. Adsorptivni gubici su nula. Nakon nekoliko godina rada napokon smo postavili hromatografsku separaciju za koju vjerujemo da će obezbjediti konstantne rezultate za NHANES analize (16).

Iako je ovaj metod manji od idealnog, ipak je poboljšao preciznost u uporedbi sa DiaSorin RIA (CV ≤11% i ≤16% for 25(OH)D3 i 25(OH)D2).

Buduća poboljšanja

Iako je većina uzoraka dala ponovljene rezultate koristeći našu LC-MS/MS metodu, niske koncentracije 25(OH)D2 u nekim uzorcima nisu bile mjerljive zbog vrha osnovne interferencije u blizini 25(OH)D2. U nastojanju da se dodatno poboljša test, planirali smo za dobivanje bolje rezolucije hromatografije uz automatske obrade uzorka (Tabela 1). Nedavno smo zaključili provjeru valjanosti novog automatskog načina u kojem hromatografska odvajanja 25(OH)D2 i 25(OH)D3 od interferiranja je optimalna, ali brza (10 minuta). Metoda koristi 96 ploču koja može jednostavno obraditi 80 uzoraka po danu koristeći robota koji olakšava pipetiranje. Druga poboljšanja uključuju testiranje manjih volumena seruma (100 μL) u uključuje izotope označene 25(OH)D2 kao drugi interni standard. Tabela 2 daje karakteristike ovog testa.

 

Tabela 1

Karakteristike LC-MS/MS metoda za 25(OH)D2 i 25(OH)D3

Format

96-ploča

Instrument

Thermo Quantum Ultra

25(OH)D2 & 25(OH)D3 raspon kalibracije

6–125 i 13–250 nmol/L

Interni standardi (označeni-deuterijem)

D6-25(OH)D3 & D3-25(OH)D2

Priprema uzorka

Hamilton Starlet robot

Volumen seruma

100 μL

Mobilne faze

gradijent – metanol/voda

Vrijeme

10 minuta

Količina

80 uzoraka na dan

Poboljšanja uključuju bolju hromatografsku rezoluciju, automatska obrada uzorka, manji volumen seruma po testu i dodatak drugog internog standarda izotopski označenog 25(OH)D2.

 

 

Tabela 2
Karakteristike LC-MS/MS metoda za mjerenje 25(OH)D

Specifičnost

25(OH)D2 odvojeno kvantificiran od 25(OH)D3, ali 25(OH)D3 nije odvojen od 3-epi-25(OH)D3

Tačnost
(korištenje NIST SRM 972)

25(OH)D3 (+1% to +4%);
25(OH)D2 (–8% to +30%)

Oporavak (± SD)

25(OH)D3 (95% ± 3%); 25(OH)D2 (97% ± 3%)

Preciznost (CV)

25(OH)D3 (5%–8%); 25(OH)D2 (6%–10% at ≥7.5 nmol/L)

Senzitivnost

25(OH)D3 (<1 nmol/L); 25(OH)D2 (<1 nmol/L)

Ipak, ovo nije kraj priče. Kada je krenuo razvoj LC-MS/MS metode za praćenje 25(OH)D2 i 25(OH)D3 u NHANES, odvajanje i mjerenje C3-epimer od 25(OH)D3 nije bio cilj, jer ovaj spoj je prisutan samo u dojenčadi manje od 1 godina (14), ova dobna skupina nije praćena za 25(OH)D u NHANES. U novije vrijeme, Nacionalni institut za standarde i tehnologiju (NIST) potvrdio je prisutnost u serumu odraslih epimer koristeći LC-MS/MS kao referentni metod. Ovaj epimer, a ne koju je snimio DiaSorin RIA (14, 17), dodaje pristranost konvencionalnim metodama hromatografije jer nije riješen hromatografski od 25(OH)D3 koristeći tipične C18 HPLC kolone. Da bi se postiglo praćenje bez pristrasnosti stanja vitamina D u SAD populacije, revidirali smo našu LC-MS/MS metodu za odvajanje epimera od 25(OH)D3 i sada su u procesu validacije.

Vitamin D referentni materijali: NIST

Laboratorije takođe trebaju referentni materijal da bi obezbjedili tačnost 25(OH)D procjene. 2005, National Institutes of Health, ured dijetetskih dodataka ugovorili su sa NIST da pripreme matrice temeljene na standardnim referentnim materijalima (SRM) za 25 (OH) D (19). SRM 972 objavljen je u julu 2009, te je sada dostupan za laboratorije. Samo jedan od materijala je serum (nivo 1). Ostali su ili razrijeđen u konjskom serumu (nivo 2), ili s 25 (OH) D2 (nivo 3) ili 3-epi-25(OH)D3 (nivo 4). CDC Nutrition Laboratory je radio s NIST za mjerenje 25(OH)D kod ovih materijala koristeći automatiziranu LC-MS/MS metodu prije dodavanja proceduri drugog internog standarda (D3-25(OH)D2). Za testiranje materijala, pripremili smo duple pripreme po bočici, dvije bočice dnevno tokom 4 dana. LC-MS/MS vrijednosti su bile 1% -4% više od NIST vrijednosti za 25(OH)D3 koristeći svoje LC-MS/MS referentnu metodu, koja ima analitički koeficijent varijacije od 2 do 3%. Dogovor između CDC i NIST vrijednosti za 25(OH)D2 bila je dobra za nivoe 3 i 4 – 6% i 11% viši, ali lošije za nivoe 1 i 2 – 8% manji i 30% viši, gdje su 25(OH)D2 vrijednosti bile niske (<5 nmol / L). NIST je ugradio CDC LC-MS/MS podatke u certifikatu za SRM-972.

Odnos vrijednosti imunotesta sa vrijednostima LC/MS-MS

Duga istorija rada s DiaSorin RIA i NHANES uzorcima potaknuli su nas da istražimo povezanost tih vrijednosti sa LC-MS/MS metodom. Dakle, mi smo također karakterizirali 25(OH)D vrijednosti u SRM-972 s DiaSorin RIA koristeći isti protokol (duple mjere koristeći osam čaša više od 4 dana) za nivoe 1., 2. i 3., nivo 4 nije bio dostupan u vrijeme (Tabela 3). Nivoi 1 i 2 su unutar 12% od očekivanih vrijednosti kada je 25(OH)D2 i 25(OH)D3 su zbrojeni zajedno. Nivo 3, s 25(OH)D2, pokazalo je oko 2/3 ciljne vrijednosti, vjerojatno zbog metabolita vitamina D.

 

Tabela 3

Metoda upoređena sa SRM 972

Nivo

NIST certifikat za analizu vrijednosti LC-MS/MS (nmol/L)

CDC DiaSorin RIA (nmol/L)

25(OH)D3

25(OH)D2

Ukupno 25(OH)D

Ukupno 25(OH)D

1

59.6 ± 2.1

1.46 ± 0.49

61.1

60.5 ± 4.9

2

30.8 ± 1.5

4.14 ± 0.19

34.9

39.0 ± 4.5

3

46.2 ± 2.8

64.1 ± 4.8

110.3

72.4 ± 8.0

Nivoi 1,2 i 3 koristeći DiaSorin RIA upoređen sa NIST – certificiran (plavo) ili referentni (zeleni) vrijednosti. Srednja vrijednost± U95 za NIST podatke i srednja vrijednost ± SD za CDC podatke

 

Konačni cilj Laboratorija CDC je dobiti tačne 25(OH)D vrijednosti. Prema tome, precizne metode i referentni materijali su neophodni za utvrđivanje statusa vitamin D. Dostupnost standardnih referentnih materijala je ključni element za dobivanje tačne procjene vitamina D.

Kako će upotreba SPM materijala poboljšati 25(OH)D testiranje? CDC laboratorija će inkorporirati ove materijale u vrijednosti dnevnih kalibracija i u kalibraciju verifikacijskih postupaka obavlja se najmanje polugodišnje. Pri izradi kalibracijskih materijala, koristit ćemo SRM 972 da bi dodjelili vrijednosti nove serije.

NIST također planira objaviti SRM 2972, skup od dva materijala koji sadrže 25(OH)D2 ili 25(OH)D3 poznatih koncentracija otopljenih u otapalu. Ovi materijali su pogodni za daljnje razrjeđivanje za korištenje u linijskom ispitivanju i za kalibracijsku verifikaciju. U konačnici, dostupnost tih alata će omogućiti CDC laboratoriju da proizvedu pouzdana utvrđivanja nivoa vitamina D u SAD-u populaciji.

Za klinički laboratorij, korištenje standardnih referentnih materijala i redovno sudjelovanje u programu ispitivanja su neophodni za održavanje laboratorijskih testova.

Reference

1. DeLuca HF. Evolution of our understanding of vitamin D. Nutrition Reviews 2008;66S:73–87.

2. Haddad JG, Chyu KJ. Competitive protein-binding radioassay for 25-hydroxycholecalciferol. J Clin Endocrinol Metab 1971;33:992–5.

3. Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr 2008;88S:507–510.

4. Eisman JA, Shepard RM, DeLuca HF. Determination of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 in human plasma using high-pressure liquid chromatography. Analytical Biochemistry 1977;80:298–305.

5. Jones G. Assay of vitamins D2 and D3, and 25-hydroxyvitamins D2 and D3 in human plasma by high-performance liquid chromatography. Clin Chem 1978;24:287–98.

6. De Leenheer AP, Cruyl AA. Vitamin D3 in plasma: quantitation by mass fragmentography. Anal Biochem 1978;91:293–303.

7. Roth HJ, Schmidt-Gayk H, Weber H, Niederau C. Accuracy and clinical implications of seven 25-hydroxyvitamin D methods compared with liquid chromatography-tandem mass spectrometry as a reference. Ann Clin Biochem 2008;45:153–9.

8. Looker AC, Pfeiffer CM, Lacher DA, Schleicher RL, et al. Serum 25-hydroxyvitamin D status of the US population: 1988-1994 compared with 2000-2004. Am J Clin Nutr 2008;88:1519–27.

9. Looker AC, Lacher DA, Pfeiffer CM, Schleicher RL, et al. Data advisory with regard to NHANES serum 25-hydroxyvitamin D data. Am J Clin Nutr 2009;90(3):695.

10. CDC. Analytical Note for NHANES 2000-2006 and NHANES III (1988-1994) 25-Hydroxyvitamin D Analysis. Available online. 2009.

11. Lacher DA, Hughes JP, Carroll MD. Biological variation of laboratory tests based on the 1999-2002 National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES). Clin Chem 2009;55(S6): A15. Ref Type: Abstract

12. Fraser CG, Petersen PH, Libeer JC, Ricos C. Proposals for setting generally applicable quality goals solely based on biology. Ann Clin Biochem 1997;34:8–12.

13. Vogeser M, Kyriatsoulis A, Huber E, Kobold U. Candidate reference method for the quantification of circulating 25-hydroxyvitamin D3 by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 2004;50:1415–7.

14. Singh RJ, Taylor RL, Reddy GS, Grebe SKG. C-3 epimers can account for a significant proportion of total circulating 25-hydroxyvitamin D in infants, complicating accurate measurement and interpretation of vitamin D status. J Clin Endocrinol Metab 2006;91:3055–61.

15. Maunsell Z, Wright DJ, Rainbow SJ. Routine isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for simultaneous measurement of the 25-hydroxy metabolites of vitamins D2 and D3. Clin Chem 2005;51:1683–90.

16. Chen H, McCoy LF, Schleicher RL, Pfeiffer CM. Measurement of 25-hydroxyvitamin D3 (25OHD3) and 25-hydroxyvitamin D2 (25OHD2) in human serum using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its comparison to a radioimmunoassay method. Clinica Chimica Acta 2008;391:6–12.

17. Schmidt JA. Measurement of 25-hydroxyvitamin D revisited. Clin Chem 2006;52:2304–5.

18. Lensmeyer GL, Wiebe DA, Binkley N, Drezner MK. HPLC method for 25-hydroxyvitamin D measurement: comparison with contemporary assays. Clin Chem 2006;52:1120–6.

19. Phinney KW. Development of a standard reference material for vitamin D in serum. Am J Clin Nutr 2008;88S:511–512.

20. Vesper HW, Miller WG, Meyers GL. Reference materials and commutability. Clin Biochem Rev 2007;28:139–47.

Be the first to comment

Leave a Reply