Saliva

Često zaboravljena ali prikladna dijagnostička tekućina

Decenijama stomatolozi su mjerili puferski kapacitet pljuvačke i količinu bakterija da bi procjenili rizik nastanka oštećenja zuba (1). Danas naučnici i tehnološki napredak u biohemiji,mikrobiologiji i imunologiji vode ka otkrivanju novih biomarkera u pljuvački koji se mogu koristiti u otkrivanju sistemskih bolesti kao i ishemijske bolesti srca, srčanog zatajenja (2-4) i karcinoma (5). Ova povezanost između oralnog i prosječnog zdravlja je dovela do ponovnog interesa u korištenju pljuvačke kao dijagnostičke tečnost.

Pljuvačka daje nekoliko privilegija u poređenju sa tradicionalnom biohemijskom analizom krvi. Prikupljanje pljuvačke je neinvazivno i nije stresno. Za osobu koja uzima uzorak , pljuvačka takođe ima minimalni rizik za prenošenje infektivnih bolesti kao HPV,HCV i HIV. Pljuvačka je i idealan biofluid za zemlje u razvoju obzirom na male troškove koji su potebni za prikupljanje i obradu uzorka (Slika 1).

Slika 1. Prednosti i mane pljuvačke kao dijagnostičke tekućine

 

Tri glavne žlijezde – parotidne,submandibularna i sublingvalna i oko 400 malih žlijezda lociranih unutar usne šupljine i proizvode pljuvačku. Zdrav čuvjek izluči u prosjeku 500-1500 ml pljuvačke dnevno oko 0.5 ml/min. Pljuvačka čovjeka ima višestruke uloge u usnoj šupljini uključujući: održavanje homeostaze; pospješujući zarastanje rana; lubrikant usne šupljine; olakšava mineralizaciju zubne površine; probavljanje ugljikohidrata sa alfa-amilazom; probavljanje lipida pomoću pljuvačne lipaze; olakšava žvakanje,govor,gutanje i osjet okusa (6,7). Iako usta omogućavaju dobre uslove za rast mnogih mikroorganizama, antibaktericidno dejstvo pljuvačke pomaže održavanje oralne higijene čisteći i inhibirajući rast mikroorganizama (8).

Pljuvačka je i skladište proteina, lipida, RNA,DNA i oko 700 mikrobnih vrsta. Za unaprjeđenje kliničkog praćenja pacijenata istraživači su istraživali pljuvačku kao biofluid za ranu detekciju bolesti, prognozu i monitoring terapije. U stvari pljuvačka se već i koristila kao biološki fluid za dijagnozu i prognozu karcinoma usta,glave i vrata, periodontalne bolesti, dijabetesa i autoimunih poremećaja.

Istraživači se takođe pronašli i druge svrhe za pljuvačku. Jedan tim istraživača je identificirao biomarkere u pljuvački za detekciju ranog stadija karcinoma gušterače (9), i druge rastvorljive c-erbB-2Her2/neu u pljuvački pacijenata sa karcinomom dojke i zaključili da c-erbB može biti koristan u detekciji i monitoingu recidiva ove bolesti (10).

Trenutno istraživanje daje vrijedne podatke za dalje analize. Salivaomics je otvorena baza podataka koja sadrži salivaomics – bazirane studije i uključuje informacije o biologiji, dijagnostičkom potencijalu, farmakogenomici i farmakoproteomici pljuvačke.

Proteom pljuvačke

Pljuvačka čovjeka je ultrafiltrat plazme i sadrži proteine koji su sintetizirani in situ u pljuvačnim žlijezdama ili iz krvi. Sadrži biomarkere iz seruma, gingivalne tekućine i transudata mukoze. Do danas istraživači su identificirali 2340 proteina od kojih 20-30% se nađu i u krvi (11) što je ohrabrujući indikator u kliničkoj upotrebi pljuvačke kao dijagnostičke tekućine.

U poređenju sa proteinima plazme gdje je 99% ukupnih proteina potpomognuto sa 22 visoko vrijednih proteina (8), 20 najvažnijih proteina u ljudskoj pljuvačci sadrže samo 40% proteina (12). Ovaj sastav sugerira da detekcija biomolekula sa kliničkom senzitivnošću i specifičnošću u pljuvački bi trebalo biti lakše nego u krvi. Za razliku od proteina plazme , proteini pljuvačke su visoko osjetljivi na različite fiziološke i biohemijske procese kao što je modifikacija proteina pljuvačke u ustima što je katalizirano sa enzimima domaćina i bakterija. Ovakve modifikacije mogu predstavljati jedinstvene izazove za kliničku proteomiku pljuvačke.

Raspon proteina u pljuvački je drugi izazov. Npr. Alfa amilaza, protein pljuvačke čija koncentracija se izražava u mg/ml dok IL-6 i IL-8 su prisutni u koncentraciji od samo pg/ml. Ovo naglašava važnost razvoja alata i strategija za otkrivanje proteina sa kliničkom relevantnošću u pljuvački.

Kako se molekule transportuju iz krvi u pljuvačku može takođe biti važno za uspješnu upotrebu pljuvačke kao dijagnostičke tekućine. Lipofilne molekule kao steroidne hormoni pasivno difunduju u pljuvačku dok voda i elektroliti prolaze kroz pore acinusnih ćelija. Različiti peptidi u krvi krću se kroz proteinske kanale a veliki proteini se transportuju putem pinocitoze (4).

Komercijalno dostupni testovi

Dvije SAD kompanije su pioniri oralne dijagnostike : Epitope, Inc. I Saliva Diagnostic Systems, Inc. Oba su komercijalizirali aparate za prikupljanje pljuvačke ranih 1990., a 1996 FDA je odobrila Epitope's Orasure HIV test, prvi test koji je koristio pljuvačku za testiranje infektivnie bolesti.

U novije vrijeme FDA je odobrila prvi HIV test pomoću pljuvačke koji omogućuje ljudima da se testiraju u privatnosti. OraQuick HIV test, koji traje 15 minuta detektuje prisustvo HIV antitijela u pljuvački pomoću brisa usta.

Nekoliko kompanija van SAD ima komercijalne testove za detekciju zloupotrebe droga , uključujući Cozart Biosciences, Securetec, i Mavand. Neke od ovih kompanija šalju kitove poštom klijentima omogućavajući osobama da skupe pljuvačku ili u čašu ili sa brisom i potom da pošalju uzorak u laboratoriju na analizu.

Drugi testovi detektuju DNA u pljuvački. Canada-based DNA Genotek je bila prva kompanija koja je komercijalizirala široki raspon alata za skupljanje pljuvačke za genotipiziranje bazirano na PCR,sekvenciranju. Oralne DNA laboratorije produžnica Quest Diagnostics, takođe nudi dva testa. My PerioPath je DNA test koji određuje rizik od periodontalnih infekcija detektujući bakterijske patogene u pljuvački. OraRisk HPV je test koji određuje rizik od razvoja HPV povezanih oralnih karcinoma. Identificira različite HPV genotipove uključujući HPV 8,11,16 i 18.

Klinička primjena

Druge primjene pljuvačke u dijagnostici su detekcija kardio-vaskularnih oboljenja (2-4) i karcinoma vrata i glave (5).

Nivo CRP u pljuvački može se koristiti kao biomarker za diferencijaciju pacijenata sa ishemijskim oboljenjem srca i zdrave kontrole (2,3) (Slika 2). Denver et al su takođe pokazali da koncentracija endotelina u pljuvački (13) i nivo natriuretskog peptida (4) su korisni kao biomarkeri za procjenu zatajenja srca.

 

A

B

Slika 2. Nivo CRP u pljuvački. A. nivo CRP u pljuvački kod zdravih volontera (n=55) i kod pacijenata sa ishemijskom bolesti srca (n=28). B. Usporedba sa nivoom CRP u plazmi.

 

Dodatno , testirali smo komercijalne alate za skupljanje pljuvačke (Slika 3) da bi odredili njihovu efikasnost u detektiranju proteina pljuvačke sa varijabilnom molekularnom masom, kao što su CRP, mioglobin i IgE, kod zdravih (14) (Tabela 1). Podaci su pokazali značajnu razliku u nivoima analita.

 

Tabela 1. Efikasnost sredstava

Analit

 

Šalica za salivu/IQR

Salimetrijski bris
Srednji/IQR

Pamučni bris za pljuvačku
Srednji/IQR

Sintetički bris za pljuvačku
Srednji/IQR

CRP (pg/mL)

28/9–51

9/5–30*

19/7–46

14/5–44

IgE (pg/mL)

72/38–202

72/35–123

43/30–153

37/30–164*

Mioglobin
(pg/mL)

98/31–140

23/2–54*

23/12–52**

59/34–136

Tabela sumira podatke za središnji i interkvartilni raspon (IQR) nivoa tri analita sakupljena pomoću četiri različite metode. Uočili smo signifikantnu razliku (*p<0,05) za nivoe CRP-a i mioglobina koristeći šaljicu za pljuvačku naspram salimetrijskog sakupljanja pljuvačke, kao i signifikantnu razliku (**p<0,01) za mioglobin koristeći šaljicu za pljuvačku naspram pamučnog brisa za pljuvačku. Za IgE, nivoi sakupljeni šaljicom za pljuvačku naspram sintetičkog sakupljanja pljuvačke su  povezani (*p<0.05) (14).

Rana detekcija planocelularnog karcinoma glave i vrata (HNSCC), koji se javlja u nazalnim prolazima, sinusima, ustima, larinksu i farinksu, je još jedan od fokusa dijagnostike pljuvačke. Konzumiranje duhana je najjači riziko faktor za ovu vrstu karcinoma, a 30-50% HNSCC-a su direktna posljedica infekcije sa HPV 16, i u manjoj mjeri sa HPV 18. Metilacija DNA u ćelijama je početni događaj u formiranju karcinoma, a mi smo ustanovili metilaciju tri gena supresora (DAPK1, RASSF1A i p16) u pljuvački sakupljenoj kod pacijenata sa HNSCC koja nije prisutna kod zdravih (5).

Slika 3. Skupljanje pljuvačke. pljuvačka sakupljena u sterilnoj bočici za uzorke (A); salimetrijski bris (B); pamučni i sintetički bris (C); Greiner Bio-One sistem za sakupljanje pljuvačke (D); OriGene DNA sakupljač (E); i DNASal sakupljač (F).

 

Prepreke i napredovanje

Napredovanje dijagnostike pljuvačke ometa nekoliko faktora. Prvo, analiti u pljuvački obično su prisutni u samo 0,1 – 0,001 u odnosu na nivo u krvi, zbog toga, je potrebna vrlo osjetljiva tehnologija kako bi se razvili učinkoviti testovi. Druga prepreka je nedostatak informacija o osnovnim nivoima ili referentnim rasponima nivoa molekula u pljuvački kod zdravih. Ova informacija je presudna za razlikovanje bolesti-specifičnih promjena.

Kako bi bilo primjenjivo za kliničku upotrebu , moraju postojati i pouzdane korelacije između nivoa ciljne tvari u pljuvački i krvi/plazmi. Na primjer, mi znamo da dijagnostika pljuvačke nije dobro prilagođena za mjerenje nivoa glukoze, jer je krvni i pljuvačni nivo ovog analita u slaboj korelaciji. Ovo bi mogao biti slučaj i sa drugim analitima.

Druga komplikacija je da i najmanje onečišćenje uzorka pljuvačke sa krvlju će dovesti do lažno pozitivaih rezultata. U stvari, krvarenje nakon četkanja zuba ili čiščenja zubnim koncem se događa vrlo često i mogao bi imati za posljedicu visoku razinu lažno pozitivnih rezultata kod testova na pljuvački. Takođe je potrebno istraživanje kako bi se ustanovile promjene nivoa molekula tokom dana. Na primjer, mi znamo da je nivo hormona rasta u pljuvački viši ujutro nego tokom dana, što bi također moglo biti slučaj i za ostale biomarkere.

Nedostatak standardiziranih metoda prikupljanja pljuvačke također čini usvajanje široko rasprostranjene dijagnostike više izazovanim. U jednoj studiji, istraživači su izvijestili da OraSure prikupljač pljuvačke prepozna hepatitis C virus s većom osjetljivošću nego Salivette uređaj (15).

Šta nosi budućnost?

Kao znanje o biomolekulama prisutnim u pljuvački raste, potencijalna primjena za dijagnostiku oralnih i sistemskih bolesti će se proširiti. Iako je naučna veza između biomarkera i oralnih bolesti jasna , više studija je potrebno kako bi se razgraničili mehanizmi kojima pljuvačka odražava druge sistemske bolesti. Nadalje, prije nego što pljuvačka postane široko priznata dijagnostička tekućina, potrebno je u potpunosti razumjeti niz važnih varijabli.

Prvo, moramo definirati normalnu biološku varijabilnost biomolekula u pljuvački, kao što su dnevne promjene, varijacija unutar i između pacijenata, te efekti dobi i spola. Uticaj prehrane, lijekova, pušenja, alkohola, i fizičke aktivnosti također mogu uticati na nivo biomolekula u pljuvačci. Sa analitičkog gledišta, metodološke razlike uzrokovane sempliranjem pljuvačke, rukovanjem, te skladištenjem će morati biti definirane, kao i metodološke razlike analitičkih tehnika koje se koriste. Budući da je pljuvačni proteom osjetljiv i na vanjske i unutarnje faktore, rasponi nivoa analita u pljuvačci će morati biti pažljivo dokumentirani.

Dijagnostika pljuvačke ima ogroman potencijal za budućnost, ali moramo položiti čvrste naučne osnove u sadašnjosti kako bi se taj potencijal ostvario. Neinvazivni testovi za otkrivanje raka dojke, virusne, i bakterijske bolesti, kardiovaskularnih i metaboličkih bolesti i opće prehrambene nedostatke mogu napraviti ogroman utjecaj na globalno zdravlje.

Ključni stvari odgovorne za prenos pljuvačne dijagnostike iz laboratorije u kliničku praksu, uključujući znanstvenike, regulatorne agencije i treće strane, kao što su osiguravajuća društva, morat će raditi zajedno kako bi se utvrdilo kako je nova dijagnostika pljuvačke prihvaćena unutar zajednice zdravstvene zaštite. No, nesumnjivo, test na pljuvačku u privatnosti nečijeg doma ili u rukama doktora opšte prakse će postati stvarnost za dijagnosticiranje sistemskih bolesti.

REFERENCE

1. Lawrence HP. Salivary markers of systemic disease: noninvasive diagnosis of disease and monitoring of general health. J Can Dent Assoc 2002;68:170–4.

2. Christodoulides N, Floriano PN, Miller CS, et al. Lab-on-a-chip methods for point-of-care measurements of salivary biomarkers of periodontitis. Ann N Y Acad Sci 2007;1098:411–28.

3. Punyadeera C, Dimeski G, Kostner K, et al. One-step homogeneous C-reactive protein assay for saliva. J Immunol Methods 2011;373:19–25.

4. Yang Foo JY, Wan Y, Kostner K, et al. NT-ProBNP levels in saliva and its clinical relevance to heart failure. [Epub] PLoS One October 31, 2012 as doi:10.1371/journal.pone.0048452.

5. Ovchinnikov DA, Cooper MA, Pandit P, et al. Tumour-suppressor gene promoter hypermethylation in saliva of head and neck cancer patients. Transl Oncol 2012;5:321–6.

6. Pfaffe T, Cooper-White J, Beyerlein P, et al. Diagnostic potential of saliva: Current state and future applications. Clin Chem 2011;57:675–87.

7. Mohamed R, Campbell JL, Cooper-White J, et al. The impact of saliva collection and processing methods on CRP, IgE, and Myoglobin immunoassays. CTM 2012;1:19.

8. Schulz BL, Cooper-White J, Punyadeera CK. Saliva proteome research: Current status and future outlook. [Epub ahead of print] Crit Rev Biotechnol May 21, 2012.

9. UCLA Newsroom. Researchers find biomarkers in saliva for detection of early-stage pancreatic cancer. Available at the UCLA Newsroon online. (Accessed August 2012).

10. Streckfus CF, Mayorga-Wark O, Arreola D, et al. Breast cancer related proteins are present in saliva and are modulated secondary to ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Invest 2008;26:159–67.

11. Bandhakavi S, Stone MD, Onsongo G, et al. A dynamic range compression and three-dimensional peptide fractionation analysis platform expands proteome coverage and the diagnostic potential of whole saliva. J Proteome Res 2009;8:5590–600.

12. Loo JA, Yan W, Ramachandran P, et al. Comparative human salivary and plasma proteomes. J Dent Res 2010;89:1016–23.

13. Denver R, Tzanidis A, Martin P, et al. Salivary endothelin concentrations in the assessment of chronic heart failure. Lancet 2000;355:468–9.

14. Topkas E, Keith P, Dimeski G, et al. Evaluation of saliva collection devices for the analysis of proteins. Clin Chim Acta 2012;413:1066–70.

15. Judd A, Parry J, Hickman M, et al. Evaluation of a modified commercial assay in detecting antibody to hepatitis C virus in oral fluids and dried blood spots. J Med Virol 2003;71:49–55.

Be the first to comment

Leave a Reply