MicroRNA kao novo dijagnostičko sredstvo

glioblastomaTestiranje bioloških uzoraka na hibridizacionom nizu (array) koji sadrži knjižnicu microRNA omogućava konstruiranje microRNA ekspresionog profila za specifična biološka stanja. Ako je uzorak tumor, identitet microRNA prisutne u tumorskom tkivu može biti iskorišten u svrhe istraživanja mehanizma nastanka tumora, dobijanja prognostičkih ili dijagnostičkih informacija, ili traženja novih potencijalnih biomarkera.

Jedni od pionira razvoja microRNA baziranih proizvoda, Rosetta Genomics Laboratories (Israel), razvili su tehnologiju koja omogućava identifikaciju genomskih microRNA sekvenci velikog broja vrsta uzoraka. Njihova tehnologija pomaže u identificiranju, ekstrakciji, kvantifikaciji i analizi microRNA i mjerenju njihovog nivoa ekspresije.

Ova tehnologija je omogućila napredak velikog broja dijagnostičkih projekata koji se bave rješavanjem problema na polju kancera, zdravlja žena i drugih.

Testovi koji je proizvela Rosetta uključuju: miRview mets, test koji precizno identificira primarno tumorsko mjesto kod pacijenata koji imaju metastaze, a također otkriva pacijenate čiji tumor još nije dijagnosticiran; miRview squamous test diferencira skvamozni od ne skvamoznog, ne mikrocelularnog raka pluća (NSCLC); miRview meso – test koji koristi visoku specifičnost microRNA kao biomarkera za diferencijaciju mesothelioma, kancera koji je u vezi sa izloženošću azbestu, od drugih tipova karcinoma pluća.

Miltenyi Biotech (Njemačka) proizvodi microRNA proizvod pod nazivom miRXplore microarray. Sadrži približno 2200 microRNA koje pokrivaju humane, mišije, štakorske i virusne microRNA iz miRBase 13.0, kao i 72 kontrole.

miRXplore, proizvod Miltenyi kompanije, se koristi u profiliranju ekspresije krvnih stanica. Kontrolni ologonukleotidi pomažu u kompenzaciji greške i omogućavaju pouzdanu normalizaciju podataka. Ovaj proizvod koriste mnogi imunolozi.

Miltenyi koristi optimizirani pufer koji reducira razlike u temperaturi topljenja između adenin-timin (AT) i guanin-citozin (GC) parova. Ovo omogućava senzitivnu i specifičnu detekciju svih microRNA istovremeno. Teško je razlikovati microRNA koje su raziličite u samo jednoj nukleinskoj kiselini. Miltenyi kompanija je radila eksperimente sa umjetno napravljenom neusklađenošću (mismatch) microRNA koja se nalazila u ukupnoj RNA iz stanica hepatocelularnog karcinoma, glioblastoma, hipokampalnih stanica i CD4+ T-limfocita da bi ilustrirali relativne intenzitete signala iz jedno- ili dvostruko neusklađenih sondi (proba). Rezultati su pokazali da je kroshibridizacionih signala bilo manje od 10%, čak i u slučaju jednostrukih neusklađenosti (mismatch). Dakle, miRXplore može razlikovati microRNA članove familije koji imaju visoki stepen sličnosti sekvence.

Exiqon (USA) nudi miRcury zatvorene array testove nukleinskih kiselina (Locked Nucleic acid Arrays) za profiliranje ekspresije. LNA tehnologija koristi analoge nukleinskih kiselina u kojima metilenski most zatvara prsten riboze između 2’ oksigena i 4’ karbona. LNA mogu formirati standardne Watson-Crick parove baza, ali sa mnogo većim afinitetom nego prirodne baze. Ovo povećava senzitivnost i specičičnost microarray skrininga i minimizira hibridizacione greške koje se obično javljaju pri korištenju proba za „hvatanje” RNA ili DNA.

Verzija 11.0 miRcury Exicon array sadrži više od 1700 proba za „hvatanje”, uključujući sve microRNA koje su dostupne u miRBase 11.0, virusne microRNA povezane sa vrstama koje su u miRBase 11.0 i dodatnih 428 miRPlus proba.
Kvantitativna PCR (qPCR) se također koristi za profiliranje ekspresije microRNA.

Biotrove (USA) nudi proizvod OpenArray, za srednje do visoko procesiranje (high throughput) qPCR i microRNA profiliranje ekspresije. OpenArray tehnologija dopušta da se paralelno izvodi 2688 TaqMan qPCR reakcija. Više od 30000 podataka može biti sakupljeno u jednom danu. Platforma je dovoljno fleksibilna da se na njoj izvode skrining projekti.

Biotrove pravi OpenArray DLP eseje sa početnicama (primers) svojih klijenata u jažicama ploče. Klijent onda samo dodaje uzorak i procesira ploče u OpenArray NT cycler. Svaka OpenArray DLP ploča može da procesira do 48 odvojenih uzoraka, a OpenArray cycler može da podrži tri ploče istovremeno i odraditi program 4 puta dnevno, što znači da se za jedan dan može odraditi 576 uzoraka.

Eksperimenti profiliranja miRNA rade u istraživanja kancera i kardiovaskularnih bolesti, ali se OpenArray platform koristi i u detekciji mikroba i ekspresiji gena.

Jedna stvar čiji se razvoj čeka je microRNA sistem profiliranja ekspresije koji će prifilirati microRNA i messengerRNA u isto vrijeme, a onda ekstrahovati informacije o genskim vezama i funkcinalnim sistemima. Problem koji se treba prevazići su različiti uslovi neophodni za microRNA i mRNA “hvatanje”.

Rezultati pokazuju da je microRNA superiorna u odnosu na druge biomolekule za otkrivanje novih biomarkera.

Izvor: Labmedica

Be the first to comment

Leave a Reply