Lipidi i lipoproteini

Mary M. Kimberly, PhD

Američki Centar za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) je radio više od 50 godina na standardizaciji vrijednosti  lipida i lipoproteina za poboljšanje javnog zdravlja. Rani napori su bili fokusirani na razvoj referentnog sistema uključujući referentne procedure mjerenja i referentne materijale koji se koriste u programu standardizacije lipida. Ne samo da je ovaj program dozvolio poređenje kliničkih i epidemioloških studija, već je, također, omogućio istraživačima da prepoznaju dugoročna kretanja lipida i lipoproteina. Dalje, program standardizacije lipida je pružio uniformnu bazu za izbor pacijenta i interpretacije podataka u kliničkim i epidemiološkim studijama.

Najvažnije je  međutim, da su ovi napori omogućili stručnom timu za detekciju, evaluaciju i tretman visokog holesterola u krvi kod odraslih, poznatom kao ATP (Adult Treatment Panel) koji rade na National Heart, Lung, and Blood Institute’s (NHLBI), da razviju vodiče koje koriste liječnici za dijagnostiku, terapiju i monitoring pacijenata sa kardiovaskularnim oboljenjima. Prvi put su vodiči objavljeni 1988 (ATP I), a velike revizije su bile 1993 (ATP II)  i 2001 (ATP III) (1,2).

U isčekivanju narednog ATP IV vodiča, ovaj pregled će se fokusirati na ključne aspekte programa standardizacije lipida te će uporedit važne parametre ATP vodiča.

ATP III vodič

Low-density (niske gustoće) lipoprotein holesterol (LDL-C) je primarni cilj za tretman odraslih sa visokim holesterolom u krvi u ATP III vodiču izdanom 2001. Stručni tim revidirao je vodič 2004. godine na osnovu dodatnih kliničkih dokaza, snižavajući LDL-C terapijski nivo za ljude sa visokim rizikom od kardiovaskularnih oboljenja (Tabela 1).

Tabela 1
Revidirana ATP III klasifikacija LDL-C seruma

Kategorija rizika

Definicija rizika

LDL-C cilj

Početni TLC

Rx uzet u obzir

Visok

Sa CHD ili CHD
rizični ekvivalenti; 
FRS >20%

<100 mg/dL
Optional <70mg/dL

≥100 mg/dL

≥100 mg/dL

Umjereno visok

≥2 riziko faktora; 
FRS 10 do 20%

<130 mg/dL

≥130 mg/dL

≥130 mg/dL

Umjeren

≥2 riziko faktora; 
FRS <10%

<130 mg/dL

≥130 mg/dL

≥160 mg/dL

Nizak

0–1 riziko faktora

<160 mg/dL

≥160 mg/dL

≥190 mg/dL

Skraćenice : koronarna bolest srca (CHD), Framingham riziko skor (FRS) , terapeutske promjene životnog stila (TLC)

 

Dok ATP III stavlja najveći naglasak na LDL-C, high density (visoke gustoće) lipoprotein holesterol (HDL-C) igra značajnu ulogu. Stručni tim odredio je da je vrijednost  <40 mg/dL HDL-C nepoželjno niska i da ≥60 mg/dL se računa kao negativni riziko faktor za kardio vaskularne bolesti (Tabela 2). 

Tabela 2
ATP III klasifikacija serumskog HDL-C

HDL-C koncentracija

Riziko kategorija

<40 mg/dL

Visoka

≥60 mg/dL

Niska  (negativan riziko faktor)

 

Povišen nivo triglicerida (TG) je takođe riziko faktor za kardio vaskularna oboljenja u ATP III jer su pronađeni novi dokazi koji sugeriraju da su trigliceridi marker povišenih aterogenih lipoproteina. Prema tome, ATP III predlaže niže vrijednosti za trigliceride u poređenju sa predhodnim vodičima (Tabela 3)

Tabela 3
ATP III klasifikacija serumskih triglicerida

TG koncentracija

Rizik

<150 mg/dL

Normalan

150–199 mg/dL

Granično visok

200–499 mg/dL

Visok

≥500 mg/dL

Veoma visok

 

ApoB: Nestao u akciji?

Jedan marker koji primjetno nedostaje u vodiču ATP III je apolipoprotein B (ApoB).

ApoB je primarni apolipoprotein LDL-C partikula i uključuje ostatke lipoproteina koji su bogati trigliceridima. Postoje značajni dokazi da LDL-C i apoB koreliraju kod osoba sa normalnim nivoom triglicerida, ali nivoi apoB su nesrazmjerno visoki kod osoba sa hipertrigliceridemijom.

U 1998., istraživači su uveli vrijednost non–HDL-C kao zamjenu za apoB, koja je izvedena iz jednačine: Non-HDL-C = ukupni holesterol – HDL-C (3). Dok ATP III vodič nije uključio direktnu evaluaciju apoB, stručni tim je preporučio da laboratoriji izračunavaju non–HDL-C iz ove jednačine. Uključili su i ovaj sekundarni terapijski cilj za pacijente sa visokim trigliceridima (≥200 mg/dL) iz tri razloga: 1) Testovi za apoB koji su bili dostupni u to vrijeme nisi bili dobro standardizovani; 2) Bilo je malo prospektivnih studija za pacijente sa visokim trigliceridima koji su pokazivali veću prediktivnu moć za apoB u poređenju sa non-HDL-C; 3) Troškovi mjerenja apoB kako dodatnog testa u rutinskoj analizi lipida su bili veliki. Istraživači su kasnije pokazali da laboratorije mogu dostići kvalitativno slične rezultate za non-HDL-C i apoB bez razmatranja koncentracije triglicerida (4), dajući na dalje podršku stručnom timu da ne uključe apo B u vodiče. Ali uprkos činjenici da se non-HDL-C može izračunati iz dva standardna markera lipida i lipoproteina, ljekari i klinčki laboratoriji su usporili sa njegovim usvajanjem.

Procedure referentnih mjerenja

Kako bi se kreirao ATP III vodič, NHLBI stručni tim se oslonio na istraživačke studije iz laboratorijskih mjerenja koje su standardizirane kroz program standardizacije lipida (Lipid Standardization Program). National Cholesterol Education Panel (NCEP) sazvao je dodatni tim laboratorijskih stručnjaka, Working group on Lipoprotein Measurement, koji su, također, savjetovali NHLBI o metodi izvedbe i preporučili odabir CDC procedure referentnog mjerenja da bi standardizirali metode u kliničkim laboratorijama (5).

U to vrijeme CDC je koristio metod po Abell-Kendall za holesterol, što uključuje saponifikaciju holesterolskog estera, ekstrakciju holesterola, praćeno sa razvojem hromofora (boje za vizualizaciju) i njegovog mjerenja. (6). Za HDL-C procedura referentnog mjerenja uključuje ultracentrifugiranje da se odvoje lipoproteini veoma niske gustoće (very-low density) (VLDL) od HDL-C. Metod takođe uklanja apoB i to precipitacijom sa reagensom sastavljenim od heparina i Mn2+ jona. Na finalnom stadiju metode po Abell-Kendallu broji se preostali holesterol koji je povezan sa HDL.

Za mjerenje LDL-C, CDC koristi beta–kvantifikacijsku proceduru koja je ista kao HDL-C metoda. Metod uključuje dodatna mjerenja holesterola na donjoj frakciji (BF-C) centrifugiranja ali prije precipitacije. LDL-C se poslije izračuna pomoću jednačne: LDL-C = BF-C – HDL-C

Kroz historiju, CDC je koristio hromotropni acid metod kao proceduru referentnog mjerenja triglicerida. Ovaj metod je nedavno isključen na račun isotope dilution-gas chromatography/mass spektrometrijske metode, koji će ubrzo biti objavljen od strane CDC.

Dileme u vezi homogene direktne metode

Većina lipid i lipoprotein epidemioloških studija i kliničkih ispitivanja su koristile hemijske precipitacijske metode za mjerenje HDL-C ili su koristili Friedewald jednačinu za računanje LDL-C ili su indirektno mjerili koristeći beta-kvantifikacijski pristup. U ovakvim studijama LDL je definiran kao frakcija lipoproteina sa gustinom od 1.019–1.063 g/mL.

U praksi beta – kvantifikacijski referentni metod za LDL-C koristi ultracentrifugiranje za razdvajanje LDL-a na 1.006 kg/L, što je prirodna gustina seruma. Ova frakcija uključuje: IDL – intermediate-density (srednje gustoće) lipoprotein, nešto, ali ne i sve od lipoproteina(a); a moguće i veće apoliporoteine E (apoE) – koje sadrže HDL partikule.  Važno je napomenuti da preporučujući CDC beta-kvantifikacijski metod kao precizan, Working Group on Lipoprotein Measurement (radna grupa za mjerenje lipoproteina), učinkovito je definirala LDL kao široki traku (engl. band) gustoća koja uključuje i druge apo-B lipoproteine (5,6).

Implementacija direktnih homeogenih testova

Otkad je ATP III vodič objavljen, komercijalne homogene metode koje mjere HDL-C i LDL-C postale su široko dostupne. CDC Cholesterol Reference Method Laboratory Network (CRMLN), koja koristi referentne metode mjerenja, praćene od strane CDC-a, je standardizirao ove metode. Nekoliko objavljenih studija procjenjivalo je pouzdanost i tačnost ovih testova, u nekim slučajevima laboratorije su primjetile diskrepancu u rezultatima sa homogenim direknim HDL-C metodama. Iako su objavljene komparativne studije koje su procjenili dLDL-C i dHDL-C metode, ove studije obično su provedene sa jednim ili samo nekoliko dostupnih komercijalnih metoda, često nisu uključile poređenje sa referentnim metodama mjerenja i obično nisu uključile serum od dislipidemičnih ispitanika. Tako da laboratorije koje žele da zamjene Friedewald izračunavanje sa homogenim dLDL-C testom trebaju prvo oprezno analizirati novi test(7).

Dobra startna tačka za ovakve ocjene studija je članak objavljen od Miller et al u kojem su procjenjeni rezultati svih komecijalno dostupnih dLDL-C i  dHDL-C testova (8). Tim je prikupio uzorke od 37 ispitanika bez bolesti i od 138 ispitanika sa utvrđenim kardio-vaskularnim bolestima ili drugim stanjima koja zahtjevaju mjerenje lipoproteina i provedena je analiza u toku 48h od prikupljanja uzorka. U saradnji sa laboratorijom koji je mjerio dHDL-C i dLDL-C dok je CDC proveo proceduru referentnog mjerenja.

Istraživači su koristili NCEP ciljeve uspješnosti svakog homogenog direktnog metoda koji je testiran. Koristili su za cilj ukupnu grešku (TE), HDL-C ≤13% u odnosu na referentni metod i ≤12% za LDL-C. Preciznost ciljeva su bili odstupanje ≤5% u odnosu na referentni metod za HDL-C i  ≤4% u odnosu na LDL-C.

Za uzorke od zdravih pacijenata, šest od osam HDL-C metoda je dostiglo TE dok pet od osam LDL-C metoda je dostiglo TE cilj. Niti jedan od HDL-C ili LDL-C nije dostigao TE sa uzorcima od oboljelih pacijenata. Analiza komponenti greške pokazala je da uzorak specifični efekti kod zdravih pacijenata dominira slučajna greška u šest od osam HDL-C i LDL-C metodama i u svim HDL-C i LDL-C metodama za bolesne pacijente. Na dalje uzorak – specifični efekti su veći kod bolesnih nego kod zdravih, vodeći istraživače ka zaključku da efekti mogu biti uzrokovani sa bilo kojom komponentom u serumu koji utiče na specifičnost reagensa za HDL i LDL lipoproteinske partikule.

Analiza greške takođe je pokazala da je prosječno odstupanje dostiglo preciznost  za sve HDL-C metode za uzorke zdravih. U suprotnom, NCEP preciznost je veća kod tri od osam HDL-C metoda u grupi bolesnih. Prosječno odstupanje je takođe prekoračilo preciznost u tri od osam LDL-C metoda za obje grupe i zdrave i bolesne, i pristrasnost je bila u korelaciji sa koncentracijom triglicerida, što se očituje abnormalnostima u sastavu lipoproteina što može uticati na specifičnost dLDL-C id HDL-C metoda. U stvari visoka koncentracija triglicerida može biti zamjena za prisustvo abnormalnih lipoproteina koji mogu uticati na ove metode.

U mnogim slučajevima razlike između rezultata dHDL-C id LDL-C metoda i referentne procedure mjerenja je bilo dovoljne veličine da može uticati na klinički tretman pacijenta. Interesantno, nekoliko pacijenata u studiji je imalo genetski poremećaj u metabolizmu lipida. Njihovi rezultati dHDL-C id LDL-C značajno su se razlikovali od procedure referentnog mjerenja  tako das u mogli biti pogrešno dijagnosticirani. Iako sve ove metode su standardizovane kroz CDC CRMLN, uzorci se tipično prikupljaju za certifikaciju od osoba sa normolipidemijom i imaju triglyceride <200 mg/dL. Dakle, laboratoriji bi trebali retestirati uzorke pacijenata koji pokazuju razlike između rezultata dLDL-C i kliničkih posmatranja koristeći metodu ultracentrifugiranja.

Uticaj metode na procjenu rizika

Obzirom na varijacije posmatrane u istraživanju metodom uporedbe, kako se tačno može procjeniti rizik kardio-vaskularnih oboljenja? Van Deventer et al nedavno su objavili dodatne nalaze iz istog kohortnog uzorka opisanog iznad u kojem su procjenjivali pacijente sa rizikom od kardio-vaskularnih oboljenja prema ATP III(9). U ovoj studiji , istraživači su uporedili rezultate iz dLDL-C metoda, Friedewald izračunavanje LDL-C (cLDL-C) i proceduru referentnog mjerenja (rLDL-C). Za svakog proizvođača dHDL-C testa koristili su zajednička mjerenja za TC i TG da bi izračunali cLDL-C i uporedili sa non HDL-C koristeći rezultate iz dHDL-C metoda.

Za procjenu rizika od CVD, istraživači su podjelili kohortnu studiju u dva dijela na osnovu koncentracije triglicerida: normotrigliceridemijski ispitanici sa TG <200 mg/dL i hipertrigliceridemijski ispitanici sa TG 200–400 mg/dL. Zatim su posmatrali pacijente sa KVB rizikom bazirano na dLDL-C i cLDL-C rezultatima u odnosu na one dobijene iz rLDL-C.

Između pacijenata sa TG <200 mg/dL, dLDL-C metode nisu poboljšale tačnost riziko klasifikacije u odnosu na cLDL-C , dLDL-C teži ka klasifikaciji više ispitanika u nižu nego u višu kategoriju rizika. Kod uzoraka hipertrigliceridemije, dLDL-C metode su se pokazale bolje od cLDL-C dijelom i zbog činjenice da dHDL-C metode imaju tendenciju da daju lošije rezultate na uzorcima koji imaju nizak HDL-C i visoke TG što vodi greškama u Friedewald izračunavanju. Uprkos što se pokazao boljim od cLDL-C za uzorke sa TG između 200 i 400 mg/dL, dLDL-C metode izvode se lošije kod hipertriglceridemijskih uzoraka nego što je slučaj sa normotriglceridemijskim uzorcima. Konačno izračunavanje non-HDL-C koristeći dHDL-C metode u dobrom je odnosu sa non-HDL-C izračunat koristeći rHDL-C i non HDL-C nadmašio je i dLDL-C i cLDL-C u tačnoj klasifikaciji i normotrigliceridemijskih i hipertriglceridemijskih ispitanika.

Kako je spomenuto ranije, LDL-C referentni metod ima široku funkcionalnu definiciju LDL frakcije. Tako da ako dLDL-C metode su više specifične od referentnog mjerenja za LDL partikule i ne za druge apo-B lipoproteine kao što je IDL onda će metoda težiti da ima negativna odstupanja za rLDL-C. Ovo znači da će metoda težiti ka klasifikaciji ispitanika u niže riziko kategorije.

Jednu stvar treba imati na umu o klasifikaciji rizika za KVB, a to je da opsežna istraživanja pokazuju da drugi apo-B lipoproteini uključeni u rLDL-C mjerenju su takođe proaterogeni. Obzirom da ovi lipoproteini doprinose cLDL-C i non-HDL-C izračunavanjima, koristeći njih za klasifikaciju b trebali voditi ka boljoj učinkovitosti u klasifikaciji rizika u poređenju sad LDL-C.

Mjerenje triglicerida

Drugi riziko faktor  za KVB u ATP III vodiču su povišeni trigliceridi; rutinsko mjerenje TG ima svoje analitičke probleme. Već utvrđene metode koje se koriste u kliničkim laboratorijama za procjenu TG ustvari nisu specifične za TG. Lipaze koje se koriste u ovim metodama , uzastopno oslobađaju sve masne kiseline TG, digliceride i monogliceride za proizvodnju jednog glicerola po molekuli. Glicerol reaguje na dalje sa ostalim enzimima u testu i produkuje molekule koje mogu biti mjerene spektrofotometrijski. Većina ispitanika ima niske digliceride i monogliceride, ali ovisi od mnogih faktora uključujući i godine. U dodatku , većina uzoraka ima nizak slobodni glicerol. Biohemičari  raspravljaju o potrebi glicerolske slijepe probe (glycerol blanking) iz TG analiza.  U velikim studijama na hospitaliziranim pacijentima, nema značajnih kliničkih posljedica u rezultatima kada se ne koristi  glicerol blank (slijepa proba). (10). Izuzetak su pacijenti sa abnormalno visokim vrijednostima glicerola.

Glicerol blanking postao je izuzetno važan,  kad laboratorije pokušavaju standardizirati TG mjerenja. Komponenta glicerola na komercijalno pripremljenim materijalima, kao što su uzorci za testiranje sposobnosti, kontrole i kalibracije, može biti prilično različita u zavisnosti od matriksa izvornog materijala (zamrznut ili svjež serum) i tipa učvršćivanja koji se koristi za povećanje koncentracije lipida. Ovo čini standardizaciju TG mjerenja kroz kliničke laboratorije teškim i veoma izazovnim u procjenjivanju tačnosti rezultata. Tako da kada su ovi materijali pripremljeni od svježeg i bez ugrušaka seruma koristeći CLSI vodič C37-A, nivoi prisutnog slobodnog glicerola mogu biti smanjeni na raspon pronađen kod većine uzoraka. Laboratorije bi trebale biti dobro savjetovane da procjene svaki material na slobodni glycerol prije korištenja jer greška u TG mjerenju dovodi do greške u cLDL-C dobijen iz Friedewald jednačine.

Buduće smjernice

NHLBI ATP IV odbor radi na ažuriranju predhodnog vodiča i očekuje se njegovo objavljivanje uskoro za komentare. Među ključna razmatranja spadaju rezultati iz nedavne procjene dHDL-C i dLDL-C metoda kao i porast epidemioloških studija i kliničkih proba na biomarkerima CVD rizika. Bez sumnje kliničke laboratorije će biti na čelu provođenja najadekvatnijeg testa u novom vodiču za dijagnozu, terapiju i monitoring pacijenata.

 

REFERENCE

  1. Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. Executive summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA 2001;285:2486–97.
  2. Grundy SM, Cleeman JI, Bairey CN, Merz H, et al. Implications of recent clinical trials for the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III Guidelines. Circulation 2004;110:227–39.
  3. Frost PH, Havel RJ. Rationale for use of non–high-density lipoprotein cholesterol rather than low-density lipoprotein cholesterol as a tool for lipoprotein cholesterol screening and assessment of risk and therapy. Am J Cardiol 1998;81:26B–31B.
  4. di Angelantonio E, Sarwar N, Perry P, Kaptoge S, et al. Major lipids, apolipoproteins, and risk of vascular disease. JAMA 2009;301:1993–2000.
  5. Bachorick PS, Ross JW. National Cholesterol Education Program recommendations for measurement of low-density lipoprotein cholesterol: executive summary. Clin Chem 1995;41:1414–20.
  6. Warnick GR, Kimberly MM, Waymack PP, Leary ET, et al. Standardization of Measurements for Cholesterol, Triglycerides, and Major Lipoproteins. Lab Med 2008;39:481–490.
  7. Nauck M, Warnick GR, Rifai N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clin Chem 2002;48:236–54.
  8. Miller WG, Myers GL, Sakurabayashi I, Bachmann LM, et al. Seven direct methods for measuring HDL and LDL cholesterol compared with ultracentrifugation reference measurement procedures. Clin Chem 2010;56:977–86.
  9. van Deventer HE, Miller WG, Myers GL, Sakurabayashi I, et al. Non-HDL cholesterol shows improved accuracy for cardiovascular risk score classification compared to direct or calculated LDL cholesterol in a dyslipidemic population. Clin Chem 2011;57:490–501.
  10. Jessen R, Cass C, Eckfeldt J. Do enzymatic analyses of serum triglycerides really need blanking for free glycerol? Clin Chem 1990;36:1372–1375.

Be the first to comment

Leave a Reply