Patogeni krvi

Brza identifikacija pomoću PNA FISH

Svake godine u SAD, 350.000 pacijenata dobije infekciju krvi dok su u bolnici, što rezultira sa više od 90.000 smrtnih slučajeva i značajne troškove za zdravstveni sistem. Brza detekcija i identifikacija infektivnih patogena je presudna za povoljan ishod bolesti. Hemokultura , zlatni standard za dijagnozu infekcija krvi, često traje nekolino dana. Posljedično, kliničari liječe suspektne infekcije krvi sa antibioticima širokog spektra dok rezultati hemokulture ne budu gotovi, praksa koja je neophodna, ali ima neželjene efekte.

Nedavno, novi molekularni testovi su postali komercijalno dostupni koji brzo identificiraju patogene krvi, dajući kliničkim laboratotijama odličnu mogućnost da poboljšaju liječenje ovih pacijenata. PNA FISH – fluorescentna in situ hibridizacija pomoću peptid-nukleinskih kiselina je precizna fluorescentna metoda koja pruža potvrdu genetskih sekvenci iz mikroba pronađenih u pozitivnoj hemokulturi kao što su Staphylococcus aureus, Candida albicans, Enterococcus faecalis, i Escherichia coli. Zahvaljujući ovim informacijama, kliničari mogu odabrati adekvatnu terapiju za pacijente unutar nekoliko sati (umjesto dana) od potvrde pozitivne hemokulture.

PNA FISH test se uklapa u rad bilo koje kliničke laboratorije. Ovdje ćemo objasniti način testiranja i kako laboratorije mogu koristiti test da ubrzaju identifikaciju patogena krvi.

Tradicionalna hemokultura

Za testiranje infekcija krvi, kliničke mikrobiološke laboratorije tipično inokuliraju u tečni medij krv pacijenta i automatski instrument za hemokulturu nadgleda bakterijski rast. Pozitivne kulture se zatim boje po Gramu i izdaje se nalaz. Dok bojenje po Gramu pomaže u određivanju tipa prisutne bakterije, ono ne identificira specifični mikroorganizam koji uzrokuje infekciju kod pacijenta. Nakon dobijanja nalaza, kliničari moraju nastaviti nadgledati dodatne rezultate testova kroz nekoliko dana da bi identificirali uzročnika kao i antibiotsku osjetljivost.

Sve do nedavno, važnost identifikacije specifične vrste mikroba, nakon dobijanja nalaza bojenja po Gramu i njen uticaj na prebacivanje sa terapije antibioticima širokog spektra na ciljanu antimikrobnu terapiju često je bila neprepoznata.

Studije su dokazale je da brzo određivanje antimikrobnih sredstava i izbjegavanje antibiotika širokog spectra presudno za optimalni oporavak pacijenata sa infekcijom krvi (1–3), kao i za efikasnu upotrebu zdravstvenih resursa (4–8).

Prednosti PNA FISH metode

PNA FISH metod ima mnoge prednosti za identifikaciju patogena u pozitivnim hemokulturama. Najvažnije je što daju potvrdu vrste mikroorganizma u manje od 90 minuta dok tradicionalne metode definitivno identificiraju vrste 1-5 dana nakon identifikacije pozitivne hemokulture (Slika 1). Iako bojenje po Gramu obezbjeđuje pozitivnu identifikaciju stafilokoka iz hemokultura, postupak obično traje preko noći i potvrda vrste takođe zahtjeva subkultivaciju i biohemijske analize.

PNA FISH daje precizan rezultat kratko nakon pozitivnog nalaza bojenja po Gramu. Sa PNA FISH metodom takođe nije potrebno izolirati kolonije na agar za dodatno testiranje. Metod je jednostavan. Studije iz različitih laboratorija pokazuju da je metod visoko precizan sa visokom senzitivnošću i specifičnošću (5–10).

 

Slika 1. Tradicionalna vs. PNA FISH identifikacija patogena krvi


Prednosti korištenja PNA FISH za identifikaciju specifičnih patogena su dokumentovane u bolnicama koje koriste sistemski pristup da optimiziraju antimikrobnu terapiju, uključujući laboratorijske naučnike, farmaceute i ljekare. Npr. obzirom da su rezultati testa dostupni veoma brzo nakon pozitivne hemokulture, kliničari više ne trebaju rezultat bojenja po Gramu ili upotrebu antibiotika širokog spektra dok čekaju potvrdni laboratorijski rezultat. Pacijentima je takođe bolje jer izbjegavaju potencijalnu toksičnost lijeka i rezistenciju na antibiotike širokog spektra. Kada se povežu podaci antibiograma i procjena pacijenta, brza identifikacija vrsta sa PNA FISH omogućuje ciljanu terapiju koja je pokazala smanjenje smrtnosti, dužinu hospitalizacije i troškove liječenja (4–8).

Kako test radi

PNA FISH je baziran na komplementarnoj hibridizaciji između komercijalno dostupne sonde (AdvanDx i bioMérieux, Inc.) i ciljanog mikroorganizma. Test koristi fluoroscentno označene PNA sonde koje ciljaju specifične ribosomalne RNA (rRNA). Ove sonde sadrže iste nukleotidne baze kao i DNA; međutim PNA hibridizacijske sonde sadrže ne naelektrisane poliamide ili peptidni oslonac (backbone) prije nego negativno naelektrisani šećerno-fosfatni oslonac DNA sondi

Dizajn DNA sondi obezbjeđuje nekoliko jedinstvenih prednosti u odnosu na tradicionalne DNA sonde (11). Prvo, PNA sonde daju izvrsne karakteristike hibridizacije, jer, za razliku od DNA sondi , njihov elektronski naboj je nula. Ovo znači da PNA sonde ne podliježu odbijanju između dvije negativno naelektrisane molekule kao DNA sonde. Rezultat je da PNA sonde imaju bržu kinetiku hibridizacije koja omogućuje malim, obojenim sondama od oko 12-20 parova baza da se hibridiziraju brže do ciljane DNA. Ova jedinstvena hemija takođe olakšava diskriminaciju baza za DNA i RNA ciljeve.

Hidrofobni karakter PNA sondi takođe omogućava penetraciju kroz hidrofobni ćelijski zid bakterija mnogo lakše tokom hibridizacijskog procesa. Koristeći nekoliko PNA sondi različito označenih, jedan test može simultano identificirati nekoliko bakterijskih vrsta.

Izvođenje testa

Za izvođenje testa, tehničar priprema krvni razmaz na predmetnom staklu koristeći kap fiksacijskog rastvora i kap pozitivnog bujona hemokulture (Slika 2). Korak hibridizacije počinje dodavanjem kapi PNA sonde na predmetno staklo koji sa zatim inkubira na 55ºC , 30 minuta. Zatim tehničar ispire predmetno staklo sa zagrijanim rastvorom pufera, inkubira na 55ºC još 30 minuta i zatim stavi kap medija za montiranje na razmaz prije mikroskopiranja fluorescentnim mikroskopom. Cijeli proces, od početka do očitavanja slajda u prosjeku traje 90 minuta, od čega je najveći dio inkubacija.


Slika 2. Primjer PNA FISH metode za identifikaciju vrste Staphylococcus-a


PNA FISH sonde daju veoma profilirane rezultate za identifiaciju patogena krvi. Pod fluorescentnim mikroskopom, S.aureus se pojavljuje kao višestruki svijetlo zeleni grozdovi koka sa S.aureus/CNS PNA FISH sondom dok koagulaza negativni stafilokoki (CoNS) su crveni (Slika 3). Slično sa PNA FISH test za E.faecalis/drugi enetrokoki. E.faecalis je zeleni fluorescentni gram pozitivni koki u parovima i lancima, dok crvene fluorescentne ćelije predstvaljaju druge enterokoke.

C.albicans/C.glabrata test produkuje zelene fluorescentne ćelije za C.albicans i crvene fluorescente ćelije za C.glabrata. nedostatak fluorescencije na slajdu indicira da je neki drugi mikroorganizam prisutan u pozitivnoj hemokulturi koji ne reaguje sa vrsno-specifičnim sondama.


Procedura PNA FISH testova

1. pripremiti razmaz(5–20 min)

 2. Hibridizirati(30 min)

3. isprati (30 min.)

4. mikroskopirati i interpretirati rezultate

S. aureus

CoNS


Terapeutski uticaj

Najčešće izolirani mikroorganizmi iz hemokultura su stafilokoki, koje karakteriše njihova morfologija u obliku grozda i Gram pozitivno bojenje. S.aureus je koagulaza pozitivan, ali postoji više od 30 vrsta koagulaza negativnih stafilokoka (CoNS), 15 od njih je patogeno za čovjeka.

Nakon bojenja po Gramu hemokultura pokazuje da je pozitivna na stafilokoke, važno je identificirati da li je mikororganizam koagulaza pozitivan ili negativan. Koagulaza pozitivni rezultat ukazuje na S.aureus. ova visoko virulentna bakterija mora se tretirati brzo sa odgovarajućim antibioticima. Nalaz CoNS daje različit set pitanja. Sa CoNS, klničari moraju odlučiti da li pozitivna kultura nači stvarnu infekciju ili kontaminaciju culture sa mikroflorom kože (8). Daljnja dijagnostička odluka je činjenica da CoNS samo uzrokuje stvarnu infekciju krvi u 20% slučajeva. Posljedično, dok kontaminacija krvi sa mikroflorom kože može biti uzrok pozitivnog rezultata, kliničari često počinju antibiotsku terapiju dok čekaju potvrdu vrste. Nažalost , ova odluka rezultira sa dodatnim danima terapije vankomicinom i doprinosi razvoju vankomicin-rezistentne bakterijske flore (5,8,12).

Identifikacija vrsta Enterokokusa

Drugi čest uzrok bolničkih infekcija krvi je enterokokna bakterijemija (7). Dvije dominantne vrste dovode do najčešćih enterokoknih infekcija – Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium. Standardne metode detekcije ovih patogena uključuju dugi niz koraka nekoliko dana. Kao rezultat je početak vankomicin terapije, praksa koja je promovirala nastanak vankomicin-rezistentne enterokokne bakterijemije (VRE). U jednoj studiji , istraživači su pokazali da rana, adekvatna i precizna dijagnoza enterokoka, značajno smanjuje dužinu hospitalizacije (7). Sa PNA FISH testom za enterokoke, kliničari mogu brzo isključiti vankomicin i zamjeniti gas a ampicilinom kad je E.faecium identificiran ili početi terapiju kada je suspektna VRE.

Identifikacija vrsta Candide

Tradicionalni postupak identifikacije gljivica iz Gram pozitivnog bojenja, subkultivacije na Sabouraud dekstroza agaru, selektivnom mediju za gljive, biohemijskom testiranju, process koji traje 4-7 dana. Mikrobiološke laboratorije takođe rade subkultivaciju na CHROM agaru Candida, selektivni medij za izolaciju i identifikaciju kvasnica i filamnetoznih gljiva. Ovaj proces daje rezultate brže ali ipak zahtjeva dodatnih 18-24h nakon pozitivne hemokulture.

Dok je flukonazol terapija izbora za infekcije kvascima, prevalence drugih vrsta candied sa različitom rezistencijom znači da tačna identifikacija uzročnika smanjuje neadekvatnu terapiju i rezistenciju na flukonazol. Npr. Candida krusei je prirodno rezistentna na flukonazol i C.glabrata pokazuje doza-ovisnu osjetljivost ili lako stečenu rezistenciju. Istraživači su pronašli da upotreba PNA FISH za identifikaciju vrste Candide ne samo da smanjuje smrtnost, već i smanjuje troškove (4,6).

Uspostava PNA FISH testiranja

Osim uobičajene laboratorijske opreme, PNA FISH test zahtjeva fluorescentni mikroskop sa dvostrukim FITC/Texas crvenim filterom. Početni troškovi su minimalni i većina laboratorija ima većinu potrebne opreme.

U početnom stadiju obuke, dobra je ideja da tehničari očitavaju slajdove zajedno. To olakšava postupak i daje laboratorijskom osoblju dodatnu praksu u korištenju tehnike. Ovaj period obuke je relativno kratak zbog visoke specifičnosti i senzitivnosti testa, omogućavajući teničarima da rade sami nakon kratkog perioda. Dvokolorni format testa takođe eliminira potrebu tehničara za dodatnim skupim workshopovima, jer precizna idntifikacijasamo zahtjeva reakcije i zelene i crvene sonde. Na dalje, tehničar vidi morfologiju i fluorescentnu boju pod mikroskopom. Ćelijska morfologija ostaje očuvana takom protokola testa dajući dodatni stepen tačnosti diferencijacije vrste.

Trenutno, 9 FDA kitova su dostupni za upotrebu u laboratorijama za direktnu identifikaciju vrsta Staphylococcusa, Candide, Enterococcusa i gram negativnih bacila iz hemokultura. Specifične potrebe lokalne populacije diktiraju koji od kitova će laboratorije implementirati. (Slika 4). Rezultati bojenja po Gramu usmjerava u odabiru kita. Za pozitivni razmaz krvi sa gram negativnim bacilima, laboratorije mogu odabrati od tri kombinacije PNA FISH testova, uključujući i najnoviji FDA odobrila u decembru 2010, GNR Traffic Light koji razlikuje E.coli (zelena), K.pneumoniae (žuta) i P.aeruginosa 8crvena) u jednom testu.

Obzirom da je tok rada gotovo identičan za svaki kit i unakrsna reaktivnost nije problem. Laboratorije često koriste seriju testiranja da pojednostave obrade uzorka.


Komercijalno dostupni PNA FISH testovi

  • GBS PNA FISH from Lim Broth
  • GNR—E. coli/P. aeruginosa PNA FISH
  • GNR—EK/P. aeruginosa PNA FISH
  • GPCC—S. aureus PNA FISH
  • GPCC—S. aureus/CNS PNA FISH
  • GPCPS—E. faecalis/OE PNA FISH
  • Yeast—C. albicans PNA FISH
  • Yeast—C. albicans/C. glabrata PNA FISH
  • Yeast Traffic Light PNA FISH

Poboljšanje ishoda bolesti

Rana i adekvatna antimikrobna terapija je vitalna za ishod pacijenata inficiranih sa patogenima krvi. U poređenju sa tradicionalnim mikrobiološkim metodama, PNA FISH daje brže i definitivne rezultate iz pozitivnih hemokultura, pomažući kliničarima da poboljšaju selekciju antibiotika i rezultate ovih pacijenata. Test je lak za izvođenje i ima visoku specifičnost i senzitivnost. Preciznost i brzina ovog testa ne samo da smanjuju vrijeme hospitalizacije već i skarćuju trajanje nepotrebne antimikrobne terapije i mogućnost razvoja rezistencije.

Ukratko, precizna i brza dijagnoza infekcija krvi ima potencijal da poboljša ishod bolesti, smanjuje vrijeme hospitalizacije i smanjuje nepotrebne zdravstvene troškove. Bliska suradnja između laoratorije, apoteke i medicinskog osoblja je važan aspekt uspješne implementacije.

REFERENCE

1. Dellinger RP, Levy MM, Carlet JM, Bion J, et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008. Crit Care Med 2008;36:296–327.

2. Kumar A, Roberts D, Wood KE, et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med 2006;34:1589–96.

3. Sharma S, Kumar A. Antimicrobial management of sepsis and septic shock. Clin Chest Med 2008;29:677–87, ix.

4. Alexander BD, Ashley ED, Reller LB, Reed SD. Cost savings with implementation of PNA FISH testing for identification ofCandida albicansin blood cultures. Diagn Microbiol Infect Dis 2006;54:277–82.

5. Forrest GN, Mehta S, Weekes E, et al. Impact of rapidin situhybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures. J Antimicrob Chemother 2006;58:154–8.

6. Forrest GN, Mankes K, Jabra-Rizk MA, et al. Peptide nucleic acid fluorescencein situhybridization-based identification of Candida albicans and its impact on mortality and antifungal therapy costs. J Clin Microbiol 2006;44:3381–3.

7. Forrest GN, Roghmann MC, Toombs LS, et al. Peptide nucleic acid fluorescentin situhybridization for hospital-acquired enterococcal bacteremia: delivering earlier effective antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother 2008;52:3558–63.

8. Ly T, Gulia J, Pyrgos V, et al. Impact upon clinical outcomes of translation of PNA FISH-generated laboratory data from the clinical microbiology bench to bedside in real time. Ther Clin Risk Manag 2008;4:637–40.

9. Hensley DM, Tapia R, Encina Y. An evaluation of the advandxStaphylococcus aureus/CNS PNA FISH assay. Clin Lab Sci 2009;22:30–3.

10. Shepard JR, Addison RM, Alexander BD, et al. Multicenter evaluation of theCandida albicans/Candida glabratapeptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization method for simultaneous dual-color identification ofC. albicansandC. glabratadirectly from blood culture bottles. J Clin Microbiol 2008;46:50–5.

11. Perry-O'Keefe H, Rigby S, Oliveira K, et al. Identification of indicator microorganisms using a standardized PNA FISH method. J Microbiol Methods 2001;47:281–92.

12. Hermsen ED, Shull SS, Klepser DG, et al. Pharmacoeconomic analysis of microbiologic techniques for differentiating staphylococci directly from blood culture bottles. J Clin Microbiol 2008;46:2924–9.

Be the first to comment

Leave a Reply

Your email address will not be published.


*