labmedic-logo

Cistična fibroza

Stanley F. Lo, PhD

Cistična fibroza (CF) je autosomno recesivna bolest koja primarno nastaje kod djece. Smatra se najsmrtonosnijom genetskom bolesti kod bjelaca ako napada više sistema uključujući respiratorni, gastrointestinalni, urogenitalni trakt, gušteraču, jetru i znojne žlijezde. Aficirana djeca često imaju insuficijenciju gušterače, hronične respiratorne infekcije i povećanu koncentraciju hlorida u znoju. Egzokrina insuficijencija gušterače je prisutna kod >85% oboljelih od CF.

Ako se ne liječi, bolest uzrokuje tešku malnutriciju, smanjen rast i smrt u prvoj deceniji života. Nadoknada enzima guterače i vitamina može pomoći da se minimiziraju gastrointestinalni simptomi i nutritivne komplikacije.

Nemogućnost respiratornog sistema da prevenira infekcije je odgovorna za morbiditet i mortalitet povezan sa CF. Perzistentne respiratorne infekcije, posebno one uzrokovane sa Pseudomonas aeruginosa, mogu dovesti do nastanka bronijektazija. Smanjena plućna funkcija često dovodi do respiratornog zatajenja. Međutim, neki tretmani ublažavaju plućne bolesti. Npr. fizikalne tehnike za čišćenje vazdušnih puteva i terapija mukoliticima pomažu oslobađanju od respiratornog sekreta, antibiotici i drugi lijekovi smanjuju učestalost plućnih infekcija i upala. Potencijalni tretman je i transplantacija pluća. Uz dostupnost ovih strategija liječenja, danas je životni vijek oboljelih od CF produžen do 37 godina.

Ovaj članak će obraditi genetiku CF i detaljno opisati algoritme laboratorijskog testiranja koji se koriste za skrining CF, kao i neke njihove prednosti i nedostatke.

Genetika CF

1989, naučnici su identificirali gen odgovoran za CF. 250-kb gen sačinjen od 27 egzona za kodiranje transmembranskog proteina regulatora provodljivosti (CFTR), veličine 1480 aminokiselina, je lociran na dugom kraku hromozoma 7. Danas je poznato da je prevalenca mutacija ovog gena najveća kod bijelaca sjeverne Europe, Sjeverne Amerike, Australije i Novog Zelanda. Više od 1800 mutacija je prijavljeno, najčešća je delecija fenilalanina na poziciji 508. Ova mutacija je pronađena kod skoro 50% svih homozigota CF-a i >80% nosilaca CF kod Europske bijele populacije. Gotovo sve ostale mutacije imaju prevalence manje od nekoliko procenata; iako postoje izuzeci kod specifičnih populacija. Npr. kod Aškenazi židova mutacija W1282X ima prevalence od 60% i kod keltskog stanovništva mutacija G551D je dosta česta.

Ipak, CFTR genotip obično nije prediktor fenotipa ove kompleksne bolesti. Naučnici su, međutim, razdvojili genetske mutacije u različite funkcionalne klasifikacije. Najčešća shema klasifikacije ima 5 klasa ovisno o defektu u proteinskoj funkciji. (Tabela 1). Klasa I mutacija rezultira u smanjenoj produkciji proteina; mutacioni stop kodoni su primjer ove klase. Oštećena obrada proteina prisutna je kod mutacije klase II, u kojoj je funkcija CFTR proteina malo ili nimalo prisutna. Klasa I i II mutacija su klasificirane kao "teške" i aficirane osobe često imaju insuficijenciju gušterače kao i progresivne plućne probleme. Klase III, IV i V su manje teške zbog prisustva nekih funkcija CFRT-a, i iako je smanjena njegova aktivnost općenito rezultira manje teškim CF fenotipom.

Tabela 1
Klase CFTR genskih mutacija

Klasa

CFTR protein defekt

Tip mutacije

Funkcija

I

Neispravna sinteza

Nonsense 
Frameshift
Splice junction

CFTR funkcija ukinuta

II

Neispravna obrada i sazrijavanje

Missense

CFTR funkcija ukinuta

III

Neispravna regulacija

Missense

CFTR funkcija ukinuta

IV

Oštećena provodnost

Missense

Rezidualna ekspresija i funkcija

V

Reducirana sinteza/funkcija

Splicing defects
Missense mutations

Rezidualna ekspresija i funkcija

Adaptirano iz: Castellani C, Cuppens H, Macek Jr M, et. al. Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice. J Cyst Fibros 2008;7:179–96.

 

Genotip i fenotip

Još uvijek se pretpostavlja i ne zna tačno, kako mutacije u CFTR genu rezultiraju u fenotipu. U takozvanoj low-volume hipotezi, CFTR preotein regulira transport hlorida tako što utiče na jonske kanale, uključujući i epitelijalne natrijumske kanale. Posljedica ne funkcionisanja ili parcijalnog funkcionisanja CFTR proteina je porast aktivnosti natrijumskih kanala.

Rezultat je povećan transport natrijuma kroz epitelijalne membrane, što je u ovom slučaju lumen dišnih puteva prema submukozi pluća. Disbalans vodi ka povećanju ulaska vode u stanice, jer voda prati pomjeranje soli, i naknadne dehidratacije sluznice dišnih puteva. Rezultat je da sekreti pluća postaju viskozniji i teški za čišćenje. Alternativna, high-salt hipoteza predlaže da se višak natrijuma i hlorida pojavljuje na površini dišnih puteva zbog smanjenja CFTR funkcionalnog proteina. Ali tačna patogeneza bolesti je nepoznata.

Dijagnoza CF

1996, Fondacija za cističnu fibrozu je objavila konsenzus za dijagnozu CF. U izvještaju, eksperti su predložili da djagnoza bude bazirana na identifikaciji jednog ili više kliničkih obilježja, kao što je prisutnost CF u porodičnoj anamnezi ili pozitivan skrining test kod novorođenčeta. Dodatno, dijagnostički vodiči uključili su laboratorijske dokaze disfunkcije CFTR u vidu nalaza patoloških koncentracija hlorida u znoju u dva različita dana, prisustvo dvije mutacije u CFTR koje uzrokuju bolest, ili abnormalni test nazalne razlike potencijala (Nasal potential difference).

Hloridi u znoju

Ovaj test se smatra zlatnim standardom za dijagnozu CF; međutim, nije savršen, jer skoro 1% oboljelih od CF imaju normalne koncentracije hlorida u znoju. Naučnici su pronašli da mnogi od ovih pacijenata imaju rijedak genotip. Dalje, pacijenti koji imaju druga neobična stanja kao ekcem, anoreksiju, kongenitalnu adrenalnu hiperplaziju, adrenalnu insuficijenciju i Munchausenov sindrom mogu imati lažno pozitivne rezultate. Slično, edem, hiponatrijemija i CFTR mutacije sa očuvanom funkcijom znojnog kanala daju lažno negativne rezultate.

Sveobuhvatne smjernice Clinical Laboratory Standards Instituta, C34-A3, "Testiranje znoja: prikupljanje uzorka i kvantitiativna analiza hlorida", daju vrijedne informacije za laboratorije koje sprovode testiranje hlorida u znoju. Tabela 2 prikazuje granične vrijednosti koje se koriste za dijagnostiku CF kod djece. Vrijednosti hlorida u znoju su generalno ≥60 mEq/L kod djece sa CF. Mogu se javiti i niže vrijednosti, uključujući i koncentracije <30 mEq/L. Za bebe sa intermedijernim ili graničnim rezultatima laboratorija bi trebala ponoviti test i kliničari trebaju uputiti dijete u centar sa ekspertizom u dijagnostici CF.

Tabela  2
Vodič za interpretaciju rezultata hlorida u znoju

Hloridi u znoju (Cl–)

Godine

Normalna

Intermedijerna

Pozitivna za CF

≤6 mjeseci

≤29 mEq/L

30–59 mEq/L

≥60 mEq/L

>6 mjeseci

≤40 mEq/L

40–59 mEq/L

≥60 mEq/L

Izvor: CLSI Guideline: C34-A3, “Sweat Testing: Sample Collection and Quantitative Chloride Analysis.”

 

Danas, laboratorije primaju povećan broj zahtjeva za određivanje hlorida u znoju kao rezultat implementacije skrining programa novorođenčadi za CF. Često, djeca identificirana ovakvim programima nemaju iste kliničke odlike koje pokazuju starija djeca, povećavajući značaj testiranja hlorida u znoju u djagnozi djece sa CF.

Skrining novorođenčadi na CF

Rana detekcija CF sa skrining programom za novorođenčad omogućava duži i zdraviji život. Ova djeca mogu biti na specijalnim dijetama da bi se prevenirale nutritivne deficijencije što rezultita poboljšanim rastom i mogućnosti kognitivne funkcije. Rana dijagnoza takođe može biti od pomoći kod dobijanja genetskog savjetovanja.

Zadnjih godina nekoliko grupa je preporučilo skrining na CF, uključujući American College of Medical Genetics (ACMG), Centers for Disease Control and Prevention, i U.S. Cystic Fibrosis Foundation. Od 2009 svih 50 država i distrikt Kolumbija u SAD rade skrining novorođenčadi za CF. Programi skrininga postoje i u Australiji, Novom Zelandu, Kanadi i mnogim Europskim zemljama.

Imunoreaktivni tripsinogen u skriningu

Skrining novorođenčadi na CF se oslanja na detekciju povećanih vrijednosti imunoreaktivnog tripsinogena (IRT), enzima koji produkuje gušterača. Bebe rođene sa CF često imaju visoke vrijednosti IRT u krvi ali i druga stanja mogu uzrokovati povišene vrijednosti ovog enzima. Da bi se razumjelo kako skrining novorođenčadi funkcioniše, od pomoći je razumjevanje učestalosti mutacija IRT i CF u specifičnoj populaciji.

1979. naučnici su prvi objavili povećane vrijednosti IRT u suhim kapima krvi, dobijenim od djece sa CF. Visoke koncentracije IRT kod novorođenčadi sugeriraju na oštećenje gušterače, ali nisu specifične za CF. Koncentracija IRT opada sa godinama, tako da je negativni rezultat uobičajen u 8 nedjelji starosti, ograničavajući korisnost IRT testa kod novorođenčadi.

Najčešća metoda za detekciju IRT je direktni sendvič imunotest korištenjem kolorimetrije ili fluorimetrije. Stanice acinusa gušterače izlučuju dvije glavne izoforme IRT, IRT1 (kationski tripsinogen) i IRT2 (anionski tripsinogen). Oba se seceniraju u inaktvnom obliku i aktiviraju se u tripsinogen cijepanjem hexapeptida sa N-terminusa.

Mnogi proizvođači nisu utvrdili specifičnost njihovih testova za dvije IRT izoforme. Nadalje, IRT metode trenutno nisu usklađene pa klinička validacija svakog metoda je neophodna prije implementacije u skrining program. Multipli test za svaku izoformu je takođe komercijalno dostupan; međutim njegova uloga u skrining laboratorijama ostaje nedovoljno jasna.

IRT/IRT algoritam: za i protiv

Sve metode skriniga novorođenčadi na CF počinju sa određivanjem koncentracije IRT. Prvi stadij testiranja zahtjeva uzorak suhe kapi krvi dobijen tokom prve sedmice života novorođenčeta. Visoke koncentracije IRT, obično u opsjegu 99 – 99,5 percentile, indiciraju povećan rizik od CF i iniciraju drugi krug testiranja za koji se uzima dodatni uzorak krvi 1-3 sedmice kasnije. Zbog limitiranih podataka teško je odrediti graničnu vrijednost za drugi IRT; međutim laboratorije koriste raspon između 95-97 percentile. Novorođenčad koja i dalje pokazuju povišen nivo IRT su kandidati za test hlorida u znoju.

Ovaj pristup skriningu novorođenčadi za CF ima nekoliko nedostataka. Ponekad je teško uzeti drugi uzorak jer roditelji ne dovedu djecu na dalje testiranje. Dalje, praćenje uzoraka i precizno povezivanje sa prvim uzorkom novorođenčeta može predstavljati logističku komplikaciju. Kako je predhodno predstavljeno, takođe je teško odrediti dobre granične vrijednosti za drugi IRT test. U nekim slučajevima, dodatno testiranje je zbog lažno-pozitivnih rezultata koji su povezani sa prenatalnom asfiksijom i drugim stresovima. U prosjeku, djeca afro-amerikanci imaju visočije nivoe IRT u poređenju sa bjelcima, zbog čega se oni češće podvrgavaju drugom IRT testiranju. Na kraju, test nije dobar za detekciju heterozigotnih nosioca CTFR mutacija koji imaju smanjen nivo IRT.

Ali postoje prednosti u IRT/IRT algoritmu. Npr. Izbjegava se problem povezan sa testiranjem mutacija- detekcija mutacija nepoznate kliničke značajnosti i provođenje opsežnog skrininga za veliki broj poznatih CFTR genetskih mutacija. Moguće je poboljšati specifičnost ovog algoritma koristeći šemu koja testira treći uzorak nakon normalnog IRT na prvom testu i povećanog nivoa na drugom testu. Da bi ovaj model bio uspješan važno je da drugi i mogući treći uzorak bude adekvatno praćen i identificiran.

IRT/DNA algoritam: za i protiv

Dok IRT/IRT algoritam izbjegava komplikacije genetskog testiranja za multiple CFTR mutacije, više od 90% skrining programa za novorođenčad u SAD i Europi i svi programi na Novom Zelandu i Australiji koriste IRT/DNA algoritam. Ovaj pristup počinje sa IRT testiranjem na standardnom uzorku suhe kapi krvi novorođenčeta. U algoritmu se prvo testira na IRT, a bebama čije koncentracije prelaze 96-99 percentilu radi se DNA test na CFTR mutacije koristeći isti uzorak.

Sa više od 1.800 mutacija identificiranih na ovom genu, izbor CFTR mutacija za DNA test je kontraverzan, i mnogi komercijalni kitovi su dostupni za identifikaciju panela CFTR mutacija. U SAD, ACMG je preporučio pan-ethnic panele za skrining koji sadrže 23 CFTR mutacije (Tabela 3), što uključuje 80% pacijenata sa CF. Jasno, odabir reprezentativnih mutacija je presudan za uspostavljanje prihvatljive specifičnosti skrininga i testni panel treba uzeti u obzir najprevalentniju mutaciju kod populacije koja se podvrgava skriningu. Npr. Delta F508 mutacija se nalazi kod 72% SAD ne-latinoameričke bijele populacije; međutim, ostale populacje imaju manje procente: latinoamerička bijela , 54%; Afro-amerikanci, 44%; Azijski-amerikanci, 39% i Aškenazi židovi, 31%. 

Tabela 3
American College of Medical Genetics Skrining panel za CFTR mutacije kod pan-ethnic novorođenčadi

Naziv mutacije

delF508

2184delA

A445E

delI507

G542X

G551D

R553X

R560T

1717-1G>A

R1162X

3659delC

N1303K

W1282X

R334W

R347P

1898+1G>A

R117H

621+1G>T

2798+5G>A

G85E

711+1G>T

3120+1G>T

3849+10KbC>T

Ovaj panel sadrži 23 CFTR mutacije koje su zajedničke većini etničkih grupa. System nomenclature za mutacije kod jednostavnih DNA lezija je prihvaćen od strane šire zajednice medicinske genetike.

Za dalje objašnjenje vidjeti  Ogino S, Gulley ML, den Dunnen JT, Wilson RB. Standard mutation nomenclature in molecular diagnostics: practical and educational challenges. J Mol Diagn 2007, 9:1–6.

Kratice za aminokiseline: A–alanin; C–cistein; D–aspartat; E–glutamat; F–fenilalanin; G–glicin; H–histidin; I–izoleucin; K–lizin; N–asparagin; P–prolin; R–arginin: T–treonin; W–triptofan; and X – nedefiniran

 

Da bi se poboljšala senzitivnost skrininga, prevalentne mutacije kod populacije kojoj se vrši skrining mogu biti dodane na CFTR panel za lokalnu populaciju. Npr. Kalifornija radi skrining za 37 CFTR mutacija zbog heterogenosti populacije.

IRT/DNA algoritam identificira djecu sa jednom ili dvije CFTR mutacije. Djeca sa povišenim IRT i DNA mutacijom su takođe preporučena za testiranje hlorida u znoju. Prednosti ovog pristupa uključuju: 1) poboljšanu senzitivnost; 2) eliminacija lažno-pozitivnih IRT rezultata ponekad nađenih kod prematurusa, novorođenčadi u fizičkom stresu uslijed hospitalnih manipulacija, i Afro-američke djece; 3) dobijanje rezultata iz samo jednog uzorka, što eliminira potrebu za ponovnim dovođenjem djeteta na uzimanje drugog uzorka krvi.

Povremeno, ovaj algoritam pronađe djecu sa veoma visokim IRT ali bez DNA mutacija. U osnovi ovakav nalaz pomaže identificiranju djece sa rijetkim mutacijama. Neki smatraju ovo pozitivnim testom i predlažu test određivanja hlorida u znoju dok drugi predlažu praćenje bebe na kliničke znake i simptome.

Drugi modeli skrininga

Postoje dvije varijacije IRT/DNA algoritma: IRT/IRT/DNA i IRT/DNA/IRT. U IRT/IRT/DNA modelu, odabrana granična vrijednost za prvo određivanje IRT povećava specifičnost testa i drugi uzorak se uzima od novorođenčadi koja imaju 5-10% najviših vrjednosti. Novorođenčad koja i dalje imaju visok IRT se zatim testiraju sa CFTR mutacinim panelom i oni koji imaju jednu DNA mutaciju su kandidati za test hlorida u znoju.

U IRT/DNA/IRT modelu, novorođenčad sa visokim IRT takođe imaju analizu DNA mutacija. Ako analiza detektuje jednu mutaciju, dijete se retestira na IRT iz drugog uzorka. Djeci sa visokim drugim IRT nivoima radi se test hlorida u znoju.

Kao i drugi testni algoritmi, ova dva metoda imaju prednosti i nedostatke. Smanjuju broj testova hlorida u znoju koji se provode na novorođenčadi, ali takođe, zahtjevaju drugi uzorak i reduciraju broj detektiranih porodica nosioca. Slično IRT/DNA algoritmu, odabir CFTR mutacija koje se koriste za skrining u ovoj shemi će uticati na broj CF slučajeva detektovanih u različitim etničkim populacijama.

Još jedna varijacija IRT/DNA modela samo zahtjeva detekcju jedne CFTR mutacije. Da bi se proširila analiza, model koristi drugi genetički metod, tipično DNA sekvenciranje gena. Na žalost, velike delecije i insercije mogu biti propuštene metodom sekvenciranja, pa bi bila potrebna dodatna testiranja. Prednosti ovog modela su: reducira broj djece upućene na testiranje hlorida u znoju i mogu identificirati mutacije koje mogu imati raznoliku ekspresiju.

Još su dva testna modela vrijedna spomena. Jedan je IRT/pankreatitis-povezani protein (PAP) koji se koristi u Francuskoj. Ova shema koristi samo jedan uzorak i preliminarni podaci sugeriraju da su vrijedna daljnja istraživanja ovog modela. Drugi model dodaje treći stadij IRT/DNA metodu. Uzorci u kojima je samo jedna CFTR mutacija detektovana, testiraju se sa drugim DNA metodama, kao skeniranje gena da se odredi prisustvo dodatnih mutacija. Ovisno o skrining program, test hlorida u znoju može biti potreban za djecu sa jednom ili dvije detektovane mutacije.

Skrining na CF: ne samo novorođenčad?

Kako je mnogo napora uloženo na ranu identifikaciju novorođenčadi sa CF, skrining za CF nije ograničen na novorođenčad. American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) predlaže da svim ženama, neovisno od etničke pripadnosti ili fertilne dobi bude ponuđen skrining na CF nosioca kao dio rutinske akušerske njege, po mogućnosti prije začeća. Žene nosioci, i ako je moguće njihovi partneri, mogu zahtjevati dodatna testiranja kao i genetsko i reproduktivno svajetovanje. ACOG takođe predlaže skrining na CF za osobe sa porodičnom istorijom CF, reproduktivnim patnerima osoba sa CF, i parova u kojem su oba ili jedno bijelci ili Europljani ili Aškenazi židovi. Skrining u ovim populacijama obuhvata 23 najčešće CFTR genetske mutacije.

Svijetla budućnost

Bogatstvo znanja koje postoji danas o genetici CF skupa sa tehnološkim napretkom u molekularnom testiranju ima značajan uticaj na uspostavljanje programa skrininga novorođenčadi za ovu bolest. Samo je ograničen broj država radio skrining za CF – samo 11 u 2002 - ali sada CF skrining novorođenčadi je standardni test u svih 50 država SAD, Distriktu Kolumbija kao u mnogim drugim zemljama.

Multipli skrining algoritmi su dostupni, svaki sa prednostima i nedostacima. Budućnost skrininga novorođenčadi na CF ostaje nestabilna pošto je vrlo zahtjevan proces testiranja, uzimajući u obzir kompleksnost CFTR gena. Nove genetske tehnologije se nastavljaju razvijati svake godine, uključujući jeftino sekvenciranje DNA. Iako može biti godinama daleko, lako je predvidjeti da potpuno sekvenciranje DNA CFTR gena postane isplativo i integrisano u CF skrining programe kao i skrining drugih urođenih greški.

PREPORUČENA LITERATURA

Castellani C, Cuppens H, Macek Jr M, et al. Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice. J Cyst Fibros 2008;7:179–96.

Crossley J, Elliott R, Smith P. Dried-blood spot screening for cystic fibrosis in the newborn. Lancet 1979;1(8114):472–4.

O'Sullivan BP, Freedman SD. Cystic Fibrosis. Lancet 2009;373:1891–1904.

Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. J Pediatr 1998;132(4):589–95.

Ross LF. Newborn screening for cystic fibrosis: a lesson in public health disparities. J Pediatr 2008;153:308–13.

Sarles J, Berthezene P, Le Louarn D, et al. Combining immunoreactive trypsinogen and pancreatitis-associated protein assays, a method of newborn screening for cystic fibrosis that avoids DNA analysis. J Pediatr 2005;147:302–5.