labmedic-logo

Autoantitijela za Diabetes Tip I

Series image_10_10Predikcija i dijagnostika autoimunog dijabetesa

Troškovi za diabetes su 2007. godine dostizali nevjerovatnih 116 milijardi dolara za direktne medicinske troškove i 58 milijardi za indirektne troškove poput invalidnosti, gubitka posla i prerane smrtnosti. Danas, ova bolest prisutna je u više od 23.6 miliona ljudi u SAD ili 7.8% populacije, sa i daljim rastom ovog broja (1). Autoimuni oblik diabetesa koji je prisutan u 2-4 miliona ljudi, uključuje tip 1 dijabetes (T1D) i latentni autoimuni diabetes kod odraslih (LADA) kod dijagnosticiranog  dijabetesa tip 2 (T2D) (2). T1D, čiji je prethodni naziv inzulin-ovisni ili juvenilni diabetes mellitus, javlja se kada imuni sistem razori β-ćelije pankreasa koje produkuju hormon – inzulin koji reguliše nivo glukoze u krvi. Da bi preživjele, ove osobe moraju uzimati inzulin.

Rano otkrivanje diabetesa je važno jer ova bolest svrstava pacijente u rizičnu grupu za mnoge komplikacije pa čak i smrt. Rizik od moždanog udara ili smrti od oboljenja srca je 2-4 puta veći nego kod osoba bez diabetesa. Diabetes je takođe vodeći uzrok novih slučajeva sljepila među odraslim u dobi od 20 do 74 godina i vodeći uzrok otkazivanja funkcije bubrega, oko 44% novih slučajeva 2005. 60 – 70% pacijenata sa diabetesom imaju srednje ili teške forme oštećenja nervnog sistema i više od 60% netraumatskih amputacija nogu.

Klinička procjena

Tradicionalno, kliničari su razlikovali T1D i T2D na osnovu fenotipskih karakteristika, uključujući dob javljanja, iznenadnost pojave hiperglikemije, ketoze, stepena debljine, prevalence autoimunih bolesti i potrebe za inzulinom. Studije o autoantitijelima kod pacijenata sa diabetesom sada ukazuju da može postojati preklapanje između T1D i T2D.

Podgrupa odraslih sa dijagnozom T2D, ustvari imaju LADA. Sada poznata kao sporo razvijajuća forma autoimunog diabetesa je nađena kod osoba u dobi preko 35 godina, LADA se često pogrešno dijagnosticira kao T2D. Ovi pacijenti se klinički prezentiraju bez ketoacidoze i gubitka težine ali mnogo brže progrediraju ka inzulinskoj terapiji nego tipični T2D pacijenti (3).

U toku su klinička istraživanja za identificiranje načina za prevenciju ili promjenu smjera bolesti. Mreža ustanova TrialNet za T1D, koju čini 18 kliničkih cenatara SAD, Kanade, Europe i Australije traži način da zaustavi imuno destrukciju β ćelija pankreasa. Ova mreža će uključiti istraživanja na oralnom inzulinu, dekarboksilazu glutaminske kiselina (GAD), Rituximab (anti-CD20), metaboličku kontrolu, kao i nutricione preventivne studije sa omega-3 masnim kiselinama i dokosaheksaenoičnom kiselinom (DHA). Immune tolerance mreža također provodi istraživanja za T1D, kao i za druge autoimune bolesti, uključujući istraživanja za timoglobulin, interleukin-2 i sirolimus, kao i intranazalni inzulin.

Autoantitijela za T1D

Model predložen od strane Eisenbartha za razvoj T1D je u upotrebi već više od 20 godina (4). Opisuje T1D kao hronični, progresivni autoimuni poremećaj u kojem se kod osoba sa genetskim rizikom nakon uticaja nedefinisanih faktora okoliša pokreće destrukcija β-ćelija (5). Destrukcija β-ćelija javlja se nakon nekoliko godina i rezultira metaboličkim abnormalnostima kao tolerancijaglukoze i simptomatska hiperglikemija. Ovaj proces destrukcije β-ćelija je povezan sa udruženom produkcijom autoantitijela na β-ćelijska antigene.

1974, prvi put identificirana autoantitijela (ICAs) protiv otočića pankreasa kod T1D pacijenata koji su imali multi-endokrinu deficijenciju udruženu sa organ-specifičnom autoimunosti (6). Ustvari, ova studija je utvrdila T1D kao autoimunu bolest. Juvenile Diabetes Foundation Units (10), ICA nivoi su teški za standardizaciju jer test ovisi o substratu tkiva pankreasa. Posljedično laboratorije su zamjenile ICA testove sa testovima specifičnim za autoantitijela.

Kliničari rade testove autoantitijela da bi razlikovali autoimuni T1D i diabetes uzrokovan drugim uzrocima. Postoje tri najčešća testa za autoantitijela kao i četvrti koji je koristan za T1D testiranje.

Inzulinska autoantitijela. Iako se već dugo zna da terapija sa egzogenim oblikom inzulina može potaknuti autoantitijela protiv inzulinskih peptida, 1983. istraživači su opisali inzulinska autoantitijela (IAA) kod T1D pacijenata prije nego su primili inzulinsku terapiju (7). IAA su raznovrsna i općenito ova autoantitijela sa visokim afinitetom su prediktivna za T1D i dijele određene karakteristike, uključujući pojavu u mlađoj dobi, vezu sa HLA DRB1*4, progresiju ka kasnijoj pozitivnosti na više antitijela, vezivanje za rezidue 8-13 humanog inzulinskog lanca A i vezanje na proinzulin.

IAAs su obično prva autoantitijela koja se pojavljuju kod mlađe djece koja razviju T1D i mogu trajati nekoliko godina prije pojave T1D simptoma. Dok se ona smatraju jednim od najvažnijih autoantitijela za predviđanje T1D kod mlađe djece, današnji testovi proizvode visoko varijabilne rezultate, a samo neke kliničke laboratorije dosljedno provode test s visokom osjetljivošću i specifičnošću za bolest.

GAD65 autoantitijela. Sljedeći glavni autoantigen karakteriziran je kao 65-kDa izoforma dekarboksilaze glutaminske kiseline (GAD65) (8). Kloniranje GAD65 gena omogućava istraživačima da sintetiziraju protein sa radioizotopski označenim aminokiselinama u in vitro reakciji transkripcije/translacije i da koristie produkt kao antigen u radiovezujućem testu (RBA). U ranim stadijima GAD65 autoimuniteta, epitopi prepoznati sa GADA su primarno u srednjem dijelu proteina, ali kasnije mogu uključiti srednji/C terminalni region proteina. Autoantitijela na GAD65 su značajna u kasnoj pojavi autoimuniteta koji se viđa kod LADA pacijenata.

IA-2 ili ICA512 autoantitijela. 1995. istraživači su karakterizirali dva fragmenta antigena otočića kod osoba sa T1D. Prvi, 40 kDa fragment iz intraćelijskog dijela tirozin-fosfataza–sličnog proteina (PTPRN gen), sada se naziva IA2ic ili ICA512ic (9). Iako se IA-2 autoantitijela (IA-2A) mogu se detektirati u ranom toku autoimunosti, često se pojavljuju nakon drugih autoantitijela i imaju veću pozitivnu prediktivnu vrijednost za T1D nego GADA.

Istraživači su takođe karakterizirali druge 37-kDa fragmente kao IA-2β ili fogrin. Dok skoro sva autoantitijela koja reaguju sa IA-2β takođe reaguju sa IA-2, kliničke laboratorije tipično ne koriste IA-2β autoantitijela kao testove prve linije. Ipak, oni mogu biti korisni za identificiranje osoba sa visokim rizikom od progresije bolesti.

ZnT8 autoantitijela. Postoji veliki interes za autoantitijela koja su član porodice proteina koji prenose cink, ZnT8, za autoimuni diabetes. Istraživači su otkrili ZnT8 autoantitijela skriningom proteina u β-ćelijama pankreasa (10). ZnT8 je velika porodica proteina koji transportuju cink povezanih sa membranom sekretornih granula β-ćelija. Cink sa ovim granulama formira kompleks sa inzulinom za razvoj kristala. Humani ZnT8 postoji u tri velike polimorfne forme sa razlikama u aminokiselinama na mjestu 325: arginin, triptofan, glutamin. Arginin i triptofan oblici su najčešći a glutamin oblik je rijedak. Serum od nekih T1D pacijenata prepoznaje ZnT8 epitopekoji nisu pogođeni sa polimorfizmom na poziciji 325. njihov serum reaguje sa svim polimorfnim antigenim oblicima, ali serum nekih pacijenata je specifičan za polimorfne antigene.

Biohemijski testovi i standardizacija

ICAs mjeren sa indirektnim imunofluorescentnim testom su još uvijek među najsenzitivnijim markerima za T1D; iako su zamjenjeni sa biohemijskim testom za autoantitijela za glavne specifične proteinske antigene opisane gore. Dok većina laboratorija koriste različite forme RBA za biohemijske testove, neki komercijalni ELISA testovi sada se koriste isti ili bilji od RBAs u detekciji GAD65 (11) i IA-2ic (neobjavljeni podaci).

RBAs počinje sintezom 35S-metionin označenih antigena. Za test, laboranti inkubiraju serum sa označenim antigenom i precipitiraju anutoantitijelo-antigen sa Protein-A Sefarozom. Svaki serumski uzorak je obično dvostruko testiran na 96 mikrotitarskoj ploči. Potom se ploče operu da se uklone nevezani antigeni i mjeri se radioaktivni marker. Za IAA test, komercijalni 125I-označeni inzulin se koristi kao substrat.

Standardizacija ovih testova je izazov. Da bi se unaprijedila usporedivost mjerenja između laboratorija, SZO je usvojila referentni standard za GADA i IA-2A testove. Vrijednosti su 250 jedinica/ml za svako autoantitijelo (12). Progres na internacionalnom standardu za IAA je sporiji zbog poteškoća u skupljanju IAA pozitivnih seruma. Standardi za ZnT8 autoantitijela su takođe razvijena.

Zbog potrebe za standardizacijom testiranja autoantitijela za diabetes, Immunology of Diabetes Society (IDS) i U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) osnovali su 2000. godne Diabetes Autoantibody Standardization Program (DASP), da bi se poboljšala usporedivost i da se evaluiraju novi autoantigeni i metodologija testiranja. Cilj ove organizacije je da poboljša detekciju i dijagnostiku autoimunog diabetesa sa 1) pružanjem tehničke podrške, treningom i informacijama o najboljim metodama; 2) pružanjem ispitivanja osposobljenosti laboratorija za procjenu učinkovitosti. 3) podržavanje razvoja visoko senzitivnih i specifičnih tehnologija mjerenja; 4) razvoj referentnog materijala.

Od ovog početka, DASP je proveo šest internacionalnih radionica u kojoj laboratorijski testovi, blind uzorci od 50 pacijenata sa novim T1D i do 100 kontrolnih pacijenata. Ovaj oblik daje procjenu senzitivnosti i specifičnosti svakog testa i omogućuje DASP za procjenu implementacije metoda i dokumentuje bilo koje poboljšanje u izvođenju testova.

Među glavnim postignućima do danas, DASP je pokazao da ELISA test za mjerenje T1D autoantitijela može dati jednako dobre rezultate kao RBA, te je potvrdio ZnT8 kao četvrti glavni T1D autoantigen. Ostale aktivnosti uključuju: validaciju testa za IA-2β autoantitijela; procjenu stabilnosti standarda SZO za GADA i IA-2 autoantitijela; validaciju mjerenja afiniteta za poboljšanje izvedbe IAA testova (13), te procjenu protokola za standardne metode za GADA i IA-2A.

Laboratorije koje su učestvovale u više DASP radionica poboljšale su kvalitet svojih testiranja. 2009. laboratorije su otkrile da većina novootkrivenih uzoraka su bile pozitivne na više autoantitijela, uključujući četiri glavna autoantigena, sa uzorcima pozitivnim na GADA, IA-2 i ZnT8 autoantitijelima.

DASP takođe traži novu tehnologiju za merenje autoantitijela. Nekoliko DASP 2009 testova za autoantitijela koriste novi ne-radioaktivni test, luciferaza imunoprecipitirajući sistem (LIPS), koji djeluje obećavajuće.

Kako bi se dodatno poboljšala kvantitativna usporedba testova za GAD65 i IA- 2ic, uložen je napor od strane NIH laboratorija i DASP članica, koje su razvile protokol standardne metode (15), koji je sada dostupan za sve sudionike DASP. Konzorcij istraživačkih laboratorija Nacionalnog instituta za dijabetes i probavne i bubrežne bolesti imaju zajedničke standarde, ali  druge laboratorije sudionice DASP standardiziraju pomoću SZO standarda za GADA i IA -2A . Harmonizacija RBA testova uključuje korištenje 35S-metionina umjesto 3H-leucina kao radioizotopnog markera za sintetizirani antigen i standardizaciju na pTh-GAD65 plazmid za GADA test i pSP64-PolyA-IA-2ic plazmid za IA- 2A test. Na DASP radionicama 2009. godine, IA - 2A testovi su pokazali odličnu kvantitativnu suporedbu među laboratorijama konzorcija i podudarnosti za pozitivnost autoantitijela. Preostala razlika u GADA mjerenjima, međutim, ukazuju na to da je potreban daljnji rad da bi ovaj esej mogao uspoređivati .

Vodič: Testovi za autoantitijela za autoimuni diabetes

Iako testovi za autoantitijela nisu potrebni za standardnu brigu o dijabetičarima (16), dokazi sugeriraju da su prediktivni za T1D i pomažu da odvoje autoimuni T1D i LADA od ne-autoimunog diabetesa. Pozitivnost autoantitijela indicira da se autoimuni odgovor širi i da je bolest u progresiji (17). Prediktivna sposobnost testa za autoantitijela se povećava sa brojem autoantitijela koji su detektovani kod osoba (Slika 1a) i na nju utiče i titar autoantitijela. Tu se takođe čini da je hijerarhija diabetesa u odgovoru autoantitijela protiv različitih antigena unutar i između autoantigena (17). Npr. rizik je relativno nizak kod rodbine sa GADA ili IAA, oko 20% unutar 10 godina. Prisustvo IA-2A je povezano sa rizikom oko 50% unutar 10 godina, koji je sličan riziku multiplih non-IA-2 autoantitijela (ICA,GADA i/ili IAA) (Slika 1b). Između IA-2A pozitivnih rođaka, rizik se može dalje stratificirati prema prisustvu ili odsustvu autoantitijela na IA-2B (Slika 1c).

diabetes-slika1

a. Bazirana na broju autoantitijela

diabetes-slika2

b. Bazirano na kombinaciji autoantitijela

diabetes-slika3

c. Bazirano na IA-2A epitopima

Slika 1. Stratifikacija rizika za diabetes kod rođaka prvog stepena, T1D pacijenata pozitivnih na autoantitijela na otočiće (IAA,GADA, i/ili IA-2A), (n-180), bazirano na broju autoantitijela(a), specifičnosti autoantitijela (b) i IA-2A reaktivnosti protiv IA-2β (c).

 

Kliničari sada koriste serokonverziju za pozitivna autoantitijela kao intermedijerni stadij za osobe sa genetskim rizikom od razvoja T1D.

Buduće terapijske intervencije za oboljenje će morati razmotriti karakteristike populacije i performanse testova u skriningu bolesti. Ove strategije će se dalje razviti kada istraživači pronađu nove terapije i razviju nove testove. Dvije nove intervencione studije kod kojih je izbor pacijenata zasnovan na ICA i/ili IAA pozitivnosti, već su dokazale efikasnost autoantitijela na otočiće za predviđanje T1D (18,19). Istraživači su takođe koristili prisustvo IAA, GADA i IA-2A kao kriterij za odabir pacijenata u prevencionoj studiji za identifikaciju početka autoimunosti u prirodnom toku T1D, kao što je The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study.

REFERENCE

1. CDC Diabetes Fact Sheet, 2007, (available online).

2. Naik RG, Brooks-Worrell BM, Palmer J. Latent autoimmune diabetes in adults. J Clin Endocrinol Metab 2009; 94:4635–4644.

3. Zimmet PZ. The pathogenesis and prevention of diabetes in adults: genes, autoimmunity, and demography. Diabetes Care 1995;18:1050–1064.

4. Eisenbarth GS. Type 1 diabetes mellitus. A chronic autoimmune disease. N Engl J Med 1986;314:1360–1368.

5. Taplin CE, Barker JM. Autoantibodies in type 1 diabetes. Autoimmunity 2008;41: 11–18.

6. Bottazzo GF, Florin-Christensen A, Doniach D. Islet-cell antibodies in diabetes mellitus with autoimmune polyendocrine deficiencies. Lancet 1974;304:1279–1283.

7. Palmer JP, Asplin CM, Clemons P, et al. Insulin antibodies in insulin-dependent diabetics before insulin treatment. Science 1983;222:1337–1339.

8. Baekkeskov S, Aanstoot HJ, Christgau S, et al. Identification of the 64K autoantigen in insulin-dependent diabetes as the GABA-synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase. Nature 1990;347:151–156.

9. Payton MA, Hawkes CJ, Christie MR. Relationship of the 37,000- and 40,000- Mr tryptic fragments of islet antigens in insulin-dependent diabetes to the protein tyrosine phosphatase-like molecule IA-2 (ICA512). J Clin Invest 1995;96:1506–1511.

10. Wenzlau JM, Moua O, Sarkar SA, et al. S1C30A8 is a major target of humoral autoimmunity in type 1 diabetes and a predictive marker in prediabetes. Ann NY Acad Sci 2008;1150:256–259.

11. Torn C, Mueller PW, Schlosser M, et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for autoantigens to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2. Diabetologia 2008;1:846–852.

12. Mire-Sluis AR, Gaines Das R, Lernmark A. The World Health Organization International Collaborative Study for islet cell antibodies. Diabetologia 2000;43:1282–1292.

13. Achenbach P, Schlosser M, Williams AJK, et al. Combined testing of antibody titer and affinity improves insulin autoantibody measurement: Diabetes Autoantibody Standardization Program. Clin Immunol 2007;122:85–90.

14. Burbelo PD, Groot S, Dalakas MC, et al. High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome. Biochem Biophys Res Commun 2008;366:1–7.

15. Bonifacio E, Yu L, Williams AK, et al. Harmonization of glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2 autoantibody assays for National Institute of Diabetes Digestive and Kidney Diseases consortia. J Clin Endocrinol Metab 2010;95:3360–3367.

16. Bingley PJ. Clinical applications of diabetes antibody testing. J Clin Endocrinol Metab 2010;95:25–33.

17. Achenbach P, Warncke K, Reiter J, et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes 2004;53:384–392.

18. Bingley PJ, Gale EAM. The European Nicotinamide Diabetes Intervention Trial (ENDIT) Group, Diabetologia. Progression to type 1 diabetes in islet cell antibody-positive relatives in the European Neicotinamide Diabetes Intervention Trial: the role of additional immune, genetic and metabolic markers of risk. 2006;49:881–890.

19. Orban T, Sosenko JM, Cutherbertson D, et al. For the Diabetes Prevention Trial-Type 1 Study Group. Pancreatic islet autoantibodies as predictors of type 1 diabetes in the Diabetes Prevention Trial-Type1, Diabetes Care. 2009;32:2269–2274.

Tagovi: biohemija, imunologija, diabetes, autoimunost